Elektrophysiologischen Ableitungen aus Drosophila Embryonen erlauben Analysen der Entwicklung von Muskel-und Neuron elektrische Eigenschaften, sowie die Charakterisierung der funktionellen Synaptogenese im glutamatergen neuromuskulären Synapse und zentralen cholinergen und GABAergen Synapsen.
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Methodenartikel
Elektrophysiologische Aufzeichnung in der Drosophila Embryo
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Drosophila ist ein führender genetisches Modell für die Untersuchung der beiden embryonalen Entwicklung und funktionelle Neurowissenschaften. Traditionell sind diese Felder ganz von einander getrennt, mit weitgehend unabhängigen Geschichten und Wissenschaft. Allerdings ist die Schnittstelle zwischen diesen in der Regel unterschiedliche Felder der Entwicklungsprogramme zugrunde liegenden Erwerb von funktionellen elektrischen Signal-Eigenschaften und die Differenzierung von funktionellen chemischen Synapsen während der letzten Phasen der neuronalen Schaltkreis Bildung. Diese Schnittstelle ist ein äußerst wichtiges Gebiet für die Untersuchung. In Drosophila treten diese Phasen der funktionalen Entwicklung über einen Zeitraum von <8 Stunden (bei 25 ° C) während des letzten Drittels der Embryogenese. Diese späte Entwicklungsphase galt lange Zeit als unlösbar zu Ermittlungen wegen der Ablagerung von einem harten, undurchlässigen epidermale Kutikula. Ein Durchbruch Fortschritt war die Anwendung von Wasser-Polymerisation chirurgische Kleber, die lokal an der Nagelhaut kann angewendet werden, um kontrollierte Präparation des Late-Stage-Embryonen zu ermöglichen. Mit einem dorsalen Längsschnitt, kann der Embryo flach gelegt werden, Freilegung der Bauchmark und Körper Wand Muskulatur experimentelle Untersuchung. Whole-Cell-Patch-Clamp-Techniken kann dann eingesetzt werden, um von individuell identifizierbaren Neuronen und somatischen Muskeln aufzuzeichnen. Diese Aufnahme-Konfigurationen verwendet worden, um das Aussehen und die Reifung der Ionenströme und Aktionspotential Ausbreitung in beide Neuronen und Muskeln zu verfolgen. Genetische Mutationen nicht diese elektrischen Eigenschaften charakterisiert worden, um die molekulare Zusammensetzung von Ionenkanälen und damit verbundene Signal-Komplexen zeigen, und um die Erforschung der molekularen Mechanismen der funktionellen Differenzierung zu beginnen. Ein besonderer Schwerpunkt ist die Montage von synaptischen Verbindungen, sowohl in das zentrale Nervensystem und Peripherie. Die glutamatergen neuromuskulären Synapse (NMJ) ist am leichtesten zugängliche, eine Kombination von optischen bildgebenden und elektrophysiologischen Aufzeichnung. Ein Glas Saugelektrode wird verwendet, um die peripheren Nerven zu stimulieren, mit exzitatorischen Kreuzung Strom (EJC) Aufnahmen in der Spannungs-geklemmt Muskel gemacht. Diese Aufnahme wurde die Konfiguration verwendet werden, um die funktionale Differenzierung der Synapse-Chart, und verfolgen Sie das Aussehen und die Reifung der präsynaptischen Freisetzung von Glutamat Eigenschaften. Darüber hinaus können postsynaptischen Eigenschaften unabhängig über iontophoretischen oder Druck-Anwendung von Glutamat untersucht direkt auf den Muskel Oberfläche, um das Aussehen und die Reifung der Glutamat-Rezeptor-Felder zu messen. So können sowohl prä-und postsynaptischen Elemente einzeln oder in Kombination während der embryonalen Synaptogenese überwacht werden. Dieses System wurde stark genutzt zu isolieren und zu charakterisieren genetische Mutanten, die embryonale Synapsenbildung beeinträchtigen und damit zeigen, die molekularen Mechanismen, über die Spezifikation und Differenzierung von Synapsen-Verbindungen und funktionelle synaptische Signalisierung Eigenschaften.
Protokoll
Teil 1: Ausrüstung und Zubehör
- Elektrophysiologische Ableitungen von Drosophila Embryonen erfordert zunächst Kenntnisse in embryonalen Dissektion Techniken, die in einem anderen JoVE Video beschrieben werden.
- Elektrophysiologische Ableitungen von Drosophila Embryonen nutzt Standard-Patch-Clamp-Aufnahme-Konfigurationen. Patch-Clamp-Aufzeichnungsgeräte und Software für viele andere Präparate eignet sich auch für die Aufnahme von Drosophila-Embryos. Da Drosophila-Embryos zu einem Deckglas beim Präparieren verklebt sind, sollte die Aufnahmezeit Kammer akzeptieren Deckgläser. Die Dicke der Vorbereitung und Weise, in....
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Diskussion
Elektrophysiologische Ableitungen von Drosophila Embryonen erfordert die manuelle Manipulation und Präparation. Die Gesundheit der Vorbereitung und konsequente Qualität der Aufnahmen, hängt von einer in der Lage, schnell und sauber vorbereiten fragile embryonalen Gewebe für die Aufnahme, und führen Sie dann das Experiment. Experimentatoren sollten in beiden embryonalen Dissektionen und Patch-Clamp-Elektrophysiologie beherrschen, bevor Sie beides auf einmal anzugehen.
Die Aufnahmen k.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Offenlegungspflichten.
Danksagungen
KB wird durch NIH GM54544 unterstützt.
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Referenzen
- Aravamudan, B., Fergestad, T., Davis, W. S., Rodesch, C. K., Broadie, K. Drosophila UNC-13 is essential for synaptic transmission. Nat. Neurosci. 2, 965-971 (1999).
- Auld, V. J., Fetter, R. D., Broadie, K., Goodman, C. S. Gliotactin a novel transmem....
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Nachdrucke und Genehmigungen
