Summary
I denna video presenterar vi
Abstract
CD40-aktiverade B-celler (CD40-B-celler) har identifierats som en alternativ källa av immuno-stimulerande antigen-presenterande celler (APC) för immunterapi 1-3. Jämfört med Dendritiska celler (DC), den bästa kännetecknas APC, CD40-B-celler har flera olika biologiska och tekniska egenskaper. Liknande till utvecklingsländerna, B-celler visar ett ökat uttryck av MHC och co-stimulerande molekyler (Fig.1b), uppvisar en stark flyttande kapacitet och presentera antigen presentation effektivt för att T-celler, efter stimulering med interleukin-4 och CD40 ligand (CD40L). Men till skillnad från omogna eller mogna utvecklingsländerna, CD40-B-celler uttrycker hela lymfkörtel målsökande triad bestående av CD62L, CCR7/CXCR4 och leukocyt funktion antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), som behövs för målsökande till sekundära lymfoida organ (Fig.1a) 3. CD40-B-celler kan genereras utan svårigheter från mycket små mängder av perifert blod som kan utökas ytterligare in vitro till mycket stora mängder högt ren CD40-B-celler (> 10 9 celler per patient) från friska donatorer, liksom cancer patienter (Fig.1c, d) 1,4.
I detta protokoll visar vi hur du får fullt aktiverad CD40-B-celler från mänskliga PBMC. Viktiga molekyler för cellodling är CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) och cyklosporin A (CSA), som fylls på i en 3-4 dagars kultur cykel. För laboratorieändamål CD40-stimulering tillhandahålls av NIH/3T3 celler som uttrycker rekombinant humant CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. Att undvika kontaminering med icke-transfekterade celler, har uttryck för människans CD40 ligand på transfectants kontrolleras regelbundet (Fig.2).
Efter 14 dagar CD40-B-cellkulturer består av mer än 95% ren B-celler och en ökning av CD40-B-celler över 65 dagar är ofta möjligt utan någon förlust av funktion 1, 4. CD40-B-celler tar effektivt upp, bearbeta och presentera antigener för T-celler 6. De inte bara prime naϊve, men också utöka minnet T-celler 7,8. CD40-aktiverade B-celler kan användas för att studera B-cells aktivering, differentiering och funktion. Dessutom utgör de ett lovande verktyg för terapeutiskt eller förebyggande vaccinering mot tumörer 9.
Protocol
Protokollet för generering av mänskliga CD40-aktiverade B-celler från PBMC är uppdelad i två delar: Del A visar förberedelserna av CD40 ligand uttrycka NIH/3T3 celler, som kommer att användas som plåt-bundna feeder celler. Del B beskriver det faktiska CD40-B-kultur.
A. Beredning av feeder celler (tCD40L NIH/3T3)
Den tCD40L NIH/3T3 är en anhängare murin fibroblast cellinje, som aldrig skulle bli helt sammanhängande. Cellerna är därför uppdelad två gånger i veckan. Odling över mer än 6 veckor rekommenderas inte.
- Ta bort gammalt medium från den primära kulturen med en steril pipett och tvätta cellerna med 10 ml 1X PBS. Aspirera PBS efter tvätt.
- Tillsätt 4 ml Trypsin / EDTA i en 75 cm 2-kolv i 5-10 minuter vid 37 ° C. Använd försiktigt packas ihop för att lossa cellerna.
- Tillsätt 10 ml av vildtyp medium och vridbar försiktigt.
- Överför cellsuspension i ett 50 ml rör med en steril pipett och snurra celler nedåt vid 225 xg under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i 10 ml av vild typ medium. Räkna cellen antalet en delmängd av cellsuspensionen och förbereda tre 50 ml rör med lämpligt antal celler:
- 1,5 x 10 6 celler för subkultur
- 0,2 x 10 6 celler / brunn för bestrålning används för CD40-B-cellodling
- Återstår att frysa (om det behövs).
- Snurra cellerna nere vid 225 xg under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten.
- För subkulturodling: resuspendera 1,5 x 10 6 celler i 10 ml vildtyp medium i en 75 cm 2 cellkultur kolv (celltäthet 1,5 x 10 5 celler / ml), lägg till G-418 [0,7 mg / ml] och inkubera cellerna på 37 ° C med 5% CO 2. Dela cellerna två gånger per vecka.
- För CD40-B-cellodling: Du behöver 1,2 x 10 6 celler för en 6-brunnar. Resuspendera cellerna i vildtyp medium vid en densitet på 0,1 x 10 6 celler / ml och bestråla dem på 78 Gy. Plate 2 mL av cellsuspensionen i varje brunn och inkubera dem vid 37 ° C med 5% CO 2. Använd detta beredd plattor för B-cells stimulering när tCD40L NIH/3T3 celler anhängare (minst 4 timmar: kontrollera efterlevnaden med mikroskopet, vänta inte mer än 24 timmar att starta B-cells stimulering). (Fortsätt med B.)
B. CD 40-B-cellodling
I. Förberedelse av PBMC för CD40-stimulering (dag 0):
Observera: innan du fortsätter säkerställa att feeder celler anhängare. Tillsätt alltid färska lösningar av interleukin-4 och ciklosporin A till odlingsmedium omedelbart före användning.
- Ta PBMC, antingen färska eller lämpligt tinade. Resuspendera PBMC två gånger i 50mL 1X PBS att tvätta dem och spinn ner första gången på 265 xg under 7 minuter och en andra gång vid 190 xg under 7 minuter för att ta bort andra celler. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i 20 mL PBS. Bestäm mobilnummer i en delmängd av cellsuspensionen.
- Spinn ner önskad mängd celler vid 225 xg under 5 minuter. För en 6-brunnar 4 x 10 6 celler / brunn behövs, alltså 24 x 10 6 celler per platta.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera PBMC vid 1 x 10 6 celler / ml i CD40-B odlingsmedium nyligen kompletterats med 50 U / mL interleukin-4 som en tillväxtfaktor och 0,63 mikrogram / ml cyklosporin A för att förhindra utväxt av T-celler (koncentrationer som anges hänvisar till en mL odlingsmedium!).
- Avlägsna supernatanten från 6-brunnar före inkuberas med tCD40L NIH/3T3 celler.
- Tvätta tillhörande tCD40L NIH/3T3 celler med 2 mL PBS per brunn första och i ett andra steg med 2 ml CD40-B-tvätt medium.
- Försiktigt Tillsätt 4 ml av PBMC fjädring (1 x 10 6 celler / ml) till varje brunn på 6-brunnar.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO 2.
- Dag 7, reculture cellerna (Fortsätt med 3,2.).
II. Rekultivering av CD40-B-celler (dag 7 och därefter var 3-4 dagar):
- Harvest kluster av CD40-B-celler från 6-brunnar med resuspending med en 10 ml pipett och sammanföra dem i ett 50 ml rör.
- Spin ner vid 225 xg under 7 minuter och helt ersätta supernatanten med CD40-B tvätt medium. Samtidigt räknar cellen värdet på en alikvot, snurra celler nedåt på 225 xgi 5 minuter. Resuspendera CD40-B-celler i CD40-B odlingsmedium i en koncentration av 1 x 10 6 celler / ml.
- Lägg till nya lösningar av interleukin-4 i en koncentration av 50 U / ml och 0,63 mikrogram / ml cyklosporin A till mediet.
- Avlägsna supernatanten från en 6-brunnar före inkuberas med tCD40L NIH/3T3 celler.
- Tvätta tillhörande cellerna med 2 mL PBS per brunn första och i ett andra steg med 2 ml CD40-B-tvätt medium.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C med 5% CO 2.
- Subkultur celler igen var 3-4 dagar för att sluta med mycket rent humant CD40-aktiverade B-celler efter sammanlagt 14 dagar.
C. Felsökning - Vad händer om CD40-B-celler inte växa?
- Har du kollat för CD40 ligand uttrycket av feeder celler?
- Plattan bundna feeder celler som används för att stimulera bör inte vara äldre än 24 h?
- Är en förorening med mykoplasma möjligt?
- Var interleukin-4-lösning används för komplettering tinade friskt och hade rätt biologiska aktiviteten?
- Var cyklosporin A läggas i rätt koncentration?
Figur 1. Vänligen klicka här för en större version av figur 1.
Figur 2. Vänligen klicka här för en större version av figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Preparation of Media: | |||
| 1. Feeder cell wild type medium | |||
| DMEM-Ham’s / F12 | |||
| L-Glutamine (365 μg/mL) | |||
| FBS (10%) | |||
| HEPES (10 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| 2. Feeder cell selection medium | |||
| DMEM-Ham’s / F12 | |||
| L-Glutamine (365 μg/mL) | |||
| FBS (10%) | |||
| HEPES (10 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| G-418 (0.7 mg/mL) | |||
| 3. CD40-B washing medium | |||
| IMDM | |||
| L-Glutamine (584 μg/mL) | |||
| HEPES (25 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| 4. CD40-B culture medium | |||
| IMDM | |||
| L-Glutamine (584 μg/mL) | |||
| HEPES (25 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| rh Transferrin (50 μg/mL) | |||
| rh Insulin (5 μg/mL) | |||
| AB-Humanserum (10%) | |||
| B. Miscellaneous Reagents: | |||
| DMEM / Ham’s F12 | PAA Laboratories | Cat No: E15-813 | |
| IMDM | Invitrogen | REF 21980-032 | |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA Laboratories | Cat No H15-011 | |
| AB-Human Serum | Invitrogen | Cat No 34005100 | |
| holo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | Cat No T0665 | |
| Insulin human | Sigma-Aldrich | Cat No I2643 | |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 | |
| Recombinant Human Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 11130045 | |
| Cyclosporin A | Novartis AG | Cat No NDC 0078-0109-01 | |
| FBS | Lonza Inc. | Cat No DE14-802C | |
| HEPES Buffer | PAA Laboratories | Cat No S11-001 | |
| G-418 Sulphate | PAA Laboratories | Cat No P02-012 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. Miscellaneous Supplies: | |||
| Sterile pipette tips | Sarstedt Ltd | ||
| 6-well plate | Nalge Nunc international | Cat No 140675 | |
| 50mL conical tube | BD Biosciences | Cat No 352070 | |
| Tissue culture flask | Sarstedt Ltd | Cat No 83.1813.002 | |
References
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
- Bergwelt-Baildon, M. von CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
- Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).
- Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood. 85, 1903-1912 (1995).
- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).
- von Bergwelt-Baildon, M. S. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99, 3319-3325 (2002).
- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, 955-965 (2008).
