本文描述了利用从季节性缺氧峡湾垂直深度连续样品中分离的环境基因组DNA构建fosmid文库的方法。通过自动化菌落挑取系统，将构建的克隆文库挑取至384孔板中，以便后续测序和功能筛选，并进行存档保存。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
自然界中绝大多数微生物目前仍无法通过传统的培养方法获得。在过去十年中，不依赖培养的环境基因组学（i.e.宏基因组）方法应运而生，使研究人员能够通过直接从环境中捕获土著微生物群落的遗传物质，从而填补这一培养空白。为此，通常采用标准但技术要求较高的实验室克隆技术构建基因组DNA文库。本文描述了一种利用来自季节性缺氧峡湾垂直深度连续水体的DNA构建大插入片段环境基因组fosmid文库的方法。本实验方案与一系列相关联的实验方案直接衔接，包括近海海水采样[1]、微生物生物量的大体积过滤[2]以及DNA提取与纯化方案[3]。首先，高质量的基因组DNA经过末端修复，形成5'-磷酸化的平末端。经末端修复的DNA通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）进行片段大小筛选，并通过凝胶回收技术提取长度在30至60千碱基对（Kb）之间的DNA片段。筛选后的DNA片段从PFGE凝胶基质中纯化，并连接至经磷酸酶处理的平末端fosmid CopyControl载体pCC1（EPICENTREhttp://www.epibio.com/item.asp?ID=385). pCC1 和插入 DNA 的线性串联体随后通过 λ 末端酶进行完全包装，进入噬菌体颗粒，并进一步感染噬菌体抗性菌株E. coli细胞。在抗生素筛选条件下，成功转导的克隆将被回收至LB琼脂平板上，并使用自动化菌落挑取机器人（Qpix2, GENETIX）以384孔板格式进行存档。本实验方案综合了多种来源，包括EPICENTRE公司的CopyControl Fosmid文库构建试剂盒以及多个研究团队已发表的研究成果[4-7]。每一步操作均以最佳实践为指导原则。在可能的情况下，我们特别指出了操作中的细微要点，以提高文库构建的整体质量与效率。整个Fosmid文库构建及自动化菌落挑取过程至少需要7至10天，因其中包含多个孵育步骤。然而，本方案中也指出了若干可暂停操作的节点。
方案
fosmid文库构建分为四个主要步骤，并进一步细分为多个部分（总体流程见图1）。
步骤 I（参见方案“从 0.22 μM Sterivex 滤膜中提取 DNA”[3]）
第一部分：酶催化细胞裂解
第二部分：通过氯化铯密度梯度离心纯化环境DNA及DNA回收
第3部分：通过凝胶电泳对提取的DNA进行质量控制
第二步
第1部分：回收环境DNA的酶法修饰步骤
环境DNA末端修复步骤所需的所有试剂均包含在EPICENTRE公司的pCC1 Fosmid文库构建试剂盒中。理想情况下，基因组DNA的浓度应调整至0.5 μg/μl。
- 将所有试剂在冰上解冻，混合以下组分，并短暂离心以使所有液体沉至管底：
- x μl 无菌水
- 8 μl 10X 末端修复缓冲液
- 8 μl 2.5 mM dNTP 混合物
- 8 μl 10 mM ATP
- 最多 20 μg 剪切后的插入 DNA（约 0.5 μg/μl）
- 4 μl 末端修复酶混合物
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文描述了一种从海岸水样中提取基因组DNA并高效构建大片段插入型fosmid文库的实验方法。上游的基因组DNA提取步骤已在另一份实验方案中详细说明[3]。
由于fosmid文库的构建是一个多步骤的过程，建议至少提前两到三周规划整个实验流程，包括文中所述的四个步骤。基因组DNA的提取是最关键的一步，后续所有步骤都依赖于所提取基因组DNA的质量和数量，因此应为该步骤预留充足的时间并谨慎操作。对提取的DNA进行质量和数量的检测至关重要。在构建文库时，克隆数量偏低的情况时有发生，尤其是初次构建文库时。尽管fosmid文库的构建过程本身较为直接，但实验失败的主要原因通常在于提取和纯化的基因组DNA质量或数量不足。如果文库构建未成功，建议重新提取基因组DNA，并特别注意纯化和DNA回收过程中的各个步骤。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
我们感谢加拿大创新基金会、不列颠哥伦比亚知识发展基金以及加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）对近海和开阔大洋水体低氧区域持续研究的支持。M.T. 和 S.L. 获得了由TULA基金会资助的微生物多样性与进化中心（CMDE）提供的博士后奖学金支持。M.T. 还获得了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）的奖学金支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 第二步 | |||
| CopyControl™ Fosmid 文库构建试剂盒 | Epicentre Biotechnologies | CCFOS110 | 足够用于构建 9–10 个 fosmid 文库 |
| SeaPlaque 琼脂糖 | Cambrex | 50100 | |
| 搅拌加热板 | Corning | PC-420D | |
| 1.0× TAE 电泳缓冲液 | |||
| CHEF Mapper XA 脉冲场电泳系统（含冷却模块和可变速泵） | Bio-Rad | ||
| λ DNA-HindIII 消化产物 | New England Biolabs | N3012S | |
| MidRange I PFG 标记物 | New England Biolabs | N3551S | |
| 10,000× SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | |
| 可微波塑料保鲜膜 | Saran premium wrap | ||
| Safe Imager 透射成像仪 | Invitrogen | S37102 | |
| GELase 琼脂糖凝胶消化试剂 | Epicentre Biotechnologies | G09100 | |
| 手术刀片 | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Amicon Ultra-4 离心过滤单元（含 Ultracel-10 膜） | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Microcon YM-30 离心过滤单元 | EMD Millipore | 42410 | |
| 无核酸酶水 | Ambion | AM9932 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA 定量检测试剂盒 *2000 次检测*# | Invitrogen | P7589 | |
| 数字干式恒温仪 | VWR international | 12621-088 | |
| 水浴锅 | VWR international | 14231-854 | |
| 离心机 | Beckman Coulter Inc. | Avanti J-E | |
| 离心机转子 | Beckman Coulter Inc. | JA 5.3 | |
| 台式离心机 | Eppendorf | 5415D | |
| 1.7 mL 透明微量离心管 | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| 15 mL 离心管 | Fisher Scientific | 430052 | |
| 第三步 | |||
| LB 液体培养基 | Fisher Scientific | BP 1426-2 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| 噬菌体稀释缓冲液 | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3]，100 mM NaCl，10 mM MgCl2 | ||
| 冻存管 | Fisher Scientific | 430488 | |
| 第四步 | |||
| 带盖 96 孔板 | Fisher Scientific | CS003370(3370) | |
| 带盖 384 孔板 | Fisher Scientific | 07201157(3680) | |
| 培养皿 100 mm 直径 × 15 mm 高 | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 培养皿 150 mm 直径 × 15 mm 高 | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| BD Falcon BioDish XL 245 × 245 mm | VWR international | CABD351040 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| 氯霉素 | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| LB 液体培养基 | Fisher Scientific | BP 1426-2 | |
| Difco 琼脂 | BD Biosciences | 214530 | |
| 玻璃珠 | Fisher Scientific | 10-310-1 | |
| QFill3 | Genetix | X3050 | |
| 次氯酸钠溶液（漂白剂） | Javex | ||
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| 15 mL 离心管 | Fisher Scientific | 430052 | |
| QPix 菌落挑选仪 | Genetix | QPix2 | |
| 挑菌头（大肠杆菌用） | Genetix | X4006 |
参考文献
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
