Summary
Questo video mostra e mette a confronto due modelli sperimentali per studiare lo sviluppo della malattia delle vie aeree obliterante (OAD) nei topi, il modello eterotopico e trapianto ortotopico tracheale.
Abstract
Obliterante malattia delle vie aeree (OAD) è la complicazione maggiore dopo trapianto del polmone che limita la sopravvivenza a lungo termine (1-7).
Per studiare la fisiopatologia, il trattamento e la prevenzione di OAD, diversi modelli animali di trapianto della trachea nei roditori sono state sviluppate (1-7). Qui, usiamo due modelli consolidati di trapianto di trachea, il modello eterotopico e ortotopica e dimostrare la loro vantaggi e limiti.
Per il modello eterotopico, la trachea del donatore è avvolto nel più grande omento del destinatario, mentre la trachea del donatore viene anastomizzato da end-to-end anastomosi nel modello ortotopico.
In entrambi i modelli, lo sviluppo di lesioni istologiche obliterante simile a OAD clinica è stato dimostrato (1-7).
Questo video mostra come eseguire entrambi, il eterotopica così come la tecnica di trapianto ortotopico tracheale nei topi, e mette a confronto l'andamento temporale di sviluppo OAD in entrambi i modelli con istologia.
Protocol
- Maschio topi BALB / c (8-12 settimane) sono acquistati da Charles River Laboratories (Sulzfeld, Germania). I topi sono alloggiati in condizioni convenzionali, i topi nutriti standard di cibo e acqua ad libitum.
- 2% Isofluran viene utilizzato per l'anestesia.
DONATORE DI PREPARAZIONE
- Radersi i capelli addominale e disinfettare la zona con betaisodona.
- In vista microscopico, eseguire una incisione mediana cervicale dal livello della laringe allo sterno.
- Rimuovere il grasso sottocutaneo e dei muscoli cinghia per ottenere una visione chiara della trachea.
- Sezionare la trachea da qualsiasi tessuti circostanti, come l'esofago, nervi, arterie e del tessuto connettivo.
- Rimuovere tutta la trachea (dalla laringe alla biforcazione).
- Lavare il trapianto con soluzione fisiologica fredda e riporre l'innesto a 4 ° C.
- Il donatore è eutanasia da dislocazione cervicale dopo la raccolta della trachea.
DESTINATARIO: TRAPIANTO eterotopica
- Radersi i capelli addominale in un ampio margine intorno al sito di incisione e disinfettare l'area tre volte utilizzando betaisodona (Betadine), seguita dall'alcol. Gli occhi devono essere lubrificati con un prodotto pomata oftalmica per evitare che le cornee si secchi.
- Eseguire una laparotomia mediana e posto l'intestino in una sterile, guanti moistured.
- Stendere il omento maggiore attenzione. Posizionare l'innesto al centro e fissare con una sutura singola utilizzando 8-0 (Prolene, Ethicon, Germania).
- Coprono interamente il trapianto con il omento maggiore e fissare l'innesto con una sutura singola 8-0 (Prolene, Ethicon, Germania).
- Riposizionare l'intestino nuovamente dentro l'addome e lavare con acqua calda, soluzione salina sterile prima della chiusura.
- Primo piano in 2 strati - parete addominale e lo strato di pelle con disegno continuo utilizzando 7-0 Prolene per il muscolo e Vicryl 7-0 per la pelle.
DESTINATARIO: trapianto ortotopico
- Radersi i capelli addominale in un ampio margine intorno al sito di incisione e disinfettare l'area tre volte utilizzando betaisodona (Betadine), seguita dall'alcol. Gli occhi devono essere lubrificati con un prodotto pomata oftalmica per evitare che le cornee si secchi.
- Dividere i muscoli cinghia di visualizzare l'intero complesso laringotracheale.
- Con attenzione sezionare la trachea dai tessuti circostanti, aver cura di conservare i nervi laringeo ricorrente.
- Dividere la trachea tre anelli caudale dalla cricoide. L'animale mantiene la respirazione fisiologica attraverso la tracheostomia.
- Garantire pulizia bordi tracheale nel destinatario così come nel trapianto.
- L'innesto è interposto tra i difetti destinatario tracheale e orientato a mantenere la polarità anatomica.
- Utilizzando 8-0 (Prolene, Ethicon, Germania) anastomizzano l'innesto del donatore con il distale (mediastinica) trachea. L'aspetto posteriore della anastomosi viene eseguita in modo continuo in funzione. L'aspetto anteriore è poi completato con punti di sutura interrotta.
- Rimuovere eventuali secrezioni dalle vie aeree.
- L'anastomosi prossimale è poi completato nello stesso modo come il distale.
- Garantire l'integrità delle vie aeree e adeguata, la respirazione spontanea.
- Spostare i muscoli cinghia e chiudere il tessuto sottocutaneo e lo strato della pelle utilizzando 6-0 punti di sutura (Vicryl, Ethicon, Germania) con disegno continuo.
- Utilizzare l'anestesia iniezione per il destinatario, quindi l'animale manterrà la respirazione fisiologica attraverso la trachea. Una combinazione di 75/1/0.2 mg / kg di propofol, medetomidina e fentanil, rispettivamente, viene utilizzato per l'anestesia ip nei topi.
Figura 1: trachea del donatore.
1A: trachea del donatore in situ dopo la preparazione.
1B: trachea del donatore escisse.
1C: trachea del donatore dopo espianto.
Figura 2: Modello eterotopica.
2A: L'innesto è posizionato nel centro del omento maggiore.
2B: L'innesto è fissato su entrambe le estremità con una sutura singola.
2C: L'innesto è avvolto nel omento maggiore e fissato con una sutura singola.
Figura 3: Modello ortotopico.
3A: L'innesto è interposto tra i difetti destinatario tracheale e la parete posteriore è anastomizzato in modo continuo in funzione.
3B: La parete anteriore è completato con una sutura singola.
Figura 4: Istologia.
4A: recuperati trachea trapianto eterotopico dopo 28 giorni in + H E STAesaminando la (15x). Si noti l'obliterazione del 100% del lume.
4B: recuperati ortotopico trachea trapiantati dopo 60 giorni in H + E colorazione (15x). Obliterazione del lume massima raggiunta è di circa il 45%.
| Modello trapianto eterotopico tracheale | Modello trapianto ortotopico tracheale | |
| Vantaggi | + Facile da eseguire + Luminal obliterazione con occlusione delle vie aeree completa dopo 28 giorni + Nessuna affetto fisico degli animali da OAD | + Ventilazione fisica del trapianto + Possibile la somministrazione del farmaco per via inalatoria + Forti reazioni immunologiche come la produzione di anticorpi IgM alloreactive + Ambiente fisiologico toracica + Tracheale-anastomosi tracheale imita il setting clinico |
| Svantaggi | - Non ventilazione del trapiantato trachea - Nessuna valutazione di possibili agenti patogeni per via inalatoria - L'inibizione della clearance mucociliare e secrezioni mantenuto - Microambiente peritoneale invece di ambiente toracica | - Formazione chirurgica necessaria - Obliterazione Luminal con app occlusione del lume. 45% dopo 60 giorni - Gli animali possono sviluppare sintomi di OAD |
Tabella 1: Vantaggi e svantaggi dei eterotopica e trapianto ortotopico tracheale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I topi sono disponibili in diverse transgeneic e modello ad eliminazione diretta, e quindi adatto per lo studio meccanicistico domande relative a OAD (4).
Entrambi i modelli di trapianto della trachea mostrato in questo video può essere utilizzato come modello affidabile per lo studio dello sviluppo OAD.
Tuttavia, ogni modello dimostra vantaggi e limiti.
Il trapianto eterotopico tracheale è facile da eseguire e non richiede particolari formazione chirurgica (3, 5). Dopo il trapianto eterotopico, obliterazione del lume si verifica l'occlusione delle vie aeree veloce e completo appare dopo 28 giorni (3, 4, 6). Gli animali non sono fisicamente colpite dallo sviluppo OAD, in quanto il loro organismo non dipende dalla trachea eterotopica trapiantato.
Uno svantaggio è la mancanza di ventilazione del trapianto trachea (7, 6), quindi non è possibile valutare l'influenza di agenti patogeni per via inalatoria (3, 7). A causa della inibizione della clearance mucociliare e secrezioni mantenuto i risultati possono differire da reazioni fisiologiche visto in OAD clinico (7). Il microambiente peritoneale si differenzia dall'ambiente toracica che può anche portare a risultati alterati (3).
Per eseguire il trapianto di trachea formazione chirurgica è necessaria e obliterazione del lume della trachea trapiantato appare dopo 60 giorni invece di 28 giorni nel modello eterotopico (3, 7). Inoltre, l'obliterazione del lume massima raggiunta è app. 45% invece del 100% nel modello eterotopico (3, 7). Tuttavia, nel modello ortotopico, la ventilazione si ottiene fisiologico e la somministrazione del farmaco per via inalatoria è possibile (3). Risposta immunologica, come la produzione di anticorpi IgM alloreactive ha dimostrato di essere molto più forte in questo modello rispetto al modello eterotopico (3). L'anastomosi tracheale-tracheale e le reazioni in questo sito sono più comparabili con l'anastomosi eseguito nella clinica (7).
Vantaggi e limiti di ogni modello sono riportati in dettaglio nella tabella 1.
In sintesi, questo video mostra che sia, il eterotopica così come la tecnica di trapianto ortotopico tracheale nei topi possono essere usati come modelli riproducibili e affidabili per lo studio OAD.
Tuttavia, il modello dovrebbe essere scelto con cura a seconda della questione di fondo dello studio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sonja Schrepfer ha ricevuto un assegno di ricerca dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3-1).]
Tutti gli animali hanno ricevuto assistenza umana in conformità ai principi di cura degli animali da laboratorio, gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla Società Nazionale per la ricerca medica e la Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio pubblicato dalla National Institutes of Health (National Institutes of Health pubblicazione 85-23, revisione 1985).
Tutti gli animali sono stati ottenuti da Charles River Laboratories (Sulzfeld, Germania) e sono stati mantenuti in strutture di cura degli animali della Clinica Universitaria di Amburgo Eppendorf. Gli animali hanno ricevuto standard di cibo e acqua ad libitum.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Christiane Pahrmann (Lab Manager).
References
- Adams, B., Berry, G., Huang, X., Shorthouse, R., Brazelton, T., Morris, R. Immunosuppressive therapies for the prevention and treatment of obliterative airway disease in heterotopic rat trachea allografts. Transplantation. 69, 2260-2266 Forthcoming.
- Adams, B., Brazelton, T., Berry, G., Morris, R. The role of respiratory epithelium in a rat model of obliterative airway disease. Transplantation. 69, 661-665 Forthcoming.
- Deuse, T., Schrepfer, S., Reichenspurner, H., Hoyt, G., Fischbein, M., Robbins, R., Pelletier, M. Techniques for experimental heterotopic and orthotopic tracheal transplantations – when to use which model; Transplant Immunology 17. , 255-261 (2007).
- Hele, D., Yacoub, M., Belvisi, M. The heterotopic tracheal allograft as an animal model of obliterative bronchiolitis. Respiratory Research. 2, 169-183 Forthcoming.
- Hertz, M., Jessurun, J., King, M., Savic, S., Murray, J. Reproduction of the obliterative bronchiolitis lesion after heterotopic transplantation of mouse airways. American Journal of Pathology. 142, (1993).
- McDyer, J. Human and murine obliterative bronchiolitis in transplant. Proceedings of the American Thoracic Society. 4, 37-43 Forthcoming.
- Schrepfer, S., Deuse, T., Hoyt, G., Sheikh, A., Hoffmann, J., Reichenspurner, H., Robbins, R., Pelletier, M. Experimental orthotopic tracheal transplantation: the stanford technique. Microsurgery. 27, 187-189 (2007).
