Мы представляем В пробирке, Двухцветного анализа флуоресценции для визуализации слияние одиночных частиц вируса с двухслойной жидкости цели. Называя вирусных частиц с флуорофоров, что дифференциально пятно вирусной оболочки и ее интерьер, мы имеем возможность отслеживать кинетику hemifusion и образования пор.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Метод измерения Вирусный Кинетика Fusion на одном уровне частиц
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мембранные слияние является важным шагом в процессе вступления оболочечных вирусов в клетки. Обычные анализы слияние обычно сообщают о большом числе слияние событий, что делает ее трудно количественно проанализировать последовательность молекулярной этапов. Мы разработали в пробирке, двухцветные флуоресценцию ряда анализов для мониторинга кинетики одного слияние вирусных частиц с мишенью на двухслойной жидкости существенно поддержки.
Грипп вирусных частиц инкубируют с зеленым липофильных флуорофора запятнать мембраны и красные гидрофильные флуорофора запятнать вирусных интерьера. Мы депозита ганглиозида содержащих липидного бислоя на декстран-functionilized стеклянной поверхности проточной ячейки, инкубировать вирусных частиц на плоских двухслойных и изображения флуоресценции 100 х 100 мкм 2 области, содержащей несколько сотен частиц, на ПЗС камеры. По изображения как красный и зеленый флуоресценции, мы можем одновременно контролировать поведение мембраны красителя (зеленый) и водный контента (красный) частиц.
После снижения рН до значения ниже слияния рН, частицы сливаются с мембраной. Hemifusion, слияние внешнего листовку вирусной мембраны с внешней листовка целевой мембраны, будет видно, как внезапное изменение в зеленой флуоресценции частицы. После последующего слияния двух остающихся дистальных листовки пор будет сформирован и красно-излучающих флуорофора в вирусные частицы будет выпущен под целевой мембраны. Это событие приведет к снижению красной флуоресценции отдельных частиц. Наконец, интегрированная флуоресценции рН-чувствительных флуорофора, внедренного в целевой мембраны отчеты о точном времени рН капли.
Из трех флуоресценцию времени следы, все важные события (рН капли, липидный смешивания на hemifusion, содержание смешивания на порообразования) теперь могут быть извлечены в прямой манере и для каждой частицы в отдельности. Собирая прошедшее время для различных переходов для многих отдельных частиц в гистограммы, можно определить время жизни соответствующих промежуточных продуктов. Даже скрытые промежуточные, которые не имеют прямого флуоресцентного наблюдаемые могут быть визуализированы непосредственно из этих гистограмм.
Протокол
Стеклянная крышка скольжения функционализации
Плоский бислой, используемых в анализе слияния поддерживается на гидратированных фильм декстрана. Декстран выступает в качестве прокладки между плоскими бислоя и стеклянные поверхности. Это предотвращает мембранных компонентов из застревали на поверхности стекла, а также обеспечивает пространство в которой содержимое вирусной частицы может убежать от слияния. Стекла покровные являются функциональными с помощью лечения эпоксидной силан, который позволяет нам химически связь декстран для стекла (Elender и соавт. 1996).
- Упорядочить 25 мм покровные в керамической стойкой окраск....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Подготовка жидкости и непрерывного поддерживается бислоев липидного может оказаться непростой задачей. Следовые количества загрязняющих материалов или дефекты поверхности будут препятствовать распространению бислоев. Тщательная очистка и осаждение равномерным слоем декстран имеют важное значение.
Длительное изображений вирусных частиц может отбелить флуоресцентные метки или причинить им стать инактивируется. Фото-повреждения такого рода является хорошо известный в био-изображений и отдельных.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке грантов NIH AI57159 (для СЧ) и AI72346 (для AMvO). SCH является Медицинского института Говарда Хьюза следователь.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Квадратные покровные стекла Corning, 25 mm | Sigma-Aldrich | CLS286525 | |
| Предметные стекла из плавленого кварца | Technical Glass | ||
| Рек для окрашивания | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| (3-глицидоксипропил)триметоксисилан | Gelest Inc. | SIG5840.1 | |
| Декстран T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | |
| 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375 | |
| 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (POPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457 | |
| Холестерин | Avanti Polar Lipid, Inc | 700000 | |
| N-((6-(биотиноил)амино)гексаноил)-1,2-дигексадеканоил-sn-глицеро-3-фосф–этаноламин, соль триэтиламмония (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | |
| Стрептавидин, конъюгат с флуоресцеином | Invitrogen | S-869 | |
| Дисиалоганглиозид GD1a из мозга быка | Sigma-Aldrich | G2392 | |
| Мини-экструдер | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| Поликарбонатные мембранные фильтры 0.1 micron | Whatman, GE Healthcare | 800309 | |
| Дренажные диски 10 mm (подложки для мембран) | Whatman, GE Healthcare | 230300 | |
| Сульфородамин B, натриевая соль | S1402 | ||
| Октадецилродамин 110 (Rh110C18) | См. Floyd et al. 2008 для ознакомления с протоколом синтеза | ||
| Колонки для обессоливания PD-10 | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Флуоресцентный микроскоп Nikon | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Объектив Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA | Nikon Instruments | ||
| Аргоно-криптоновый лазер Innova 70C Spectrum | Coherent Inc. | ||
| Шприцевой насос | Harvard Apparatus | 702213 |
Ссылки
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
