We presenteren een In vitro, Twee-kleuren fluorescentie assay om de fusie van enkele virusdeeltjes te visualiseren met een vloeistof doel bilaag. Door middel van etikettering virale deeltjes met fluoroforen dat differentieel vlekken op de virale membraan en het interieur, we zijn in staat om de kinetiek van hemifusion en poriën vorming van monitoren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Methode voor het meten van virale Fusion Kinetics bij de Single Particle Level
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Membraanfusie is een essentiële stap tijdens het invoeren van envelop-virussen in cellen. Conventionele fusie assays meestal over een groot aantal van fusie gebeurtenissen, waardoor het moeilijk kwantitatief te analyseren van de volgorde van de betrokken moleculaire stappen. Hebben we een in vitro, twee-kleuren fluorescentie assay om kinetiek van enkele virusdeeltjes fusing-monitor met een doel bilaag in hoofdzaak op vloeistof te ondersteunen.
Influenza virusdeeltjes worden geïncubeerd met een groene lipofiel fluorofoor aan het membraan en een rode hydrofiele fluorofoor aan de virale interieur vlek vlek. We hebben een ganglioside-bevattende lipide bilaag afzetting op de dextran-functionilized glazen oppervlak van een flow cel, incubeer de virale deeltjes op de vlakke bilaag en het imago van de fluorescentie van een 100 x 100 micrometer 2-gebied, met daarin enkele honderden deeltjes, op een CCD camera. Door beeldvorming zowel de rode en groene fluorescentie, kunnen we tegelijkertijd toezien op het gedrag van het membraan kleurstof (groen) en de waterige inhoud (rood) van de deeltjes.
Bij het verlagen van de pH op een waarde onder de fusie pH-waarde, zullen de deeltjes fuseren met het membraan. Hemifusion, de samenvoeging van de buitenste folder van de virale membraan met de buitenste folder van het doelwit membraan, wordt zichtbaar als een plotselinge verandering in de groene fluorescentie van een deeltje. Bij de daarop volgende fusie van de twee overgebleven distale folders een porie zal worden gevormd en de rode-emitterende fluorofoor in het virale deeltje zal worden vrijgegeven onder de doelgroep membraan. Dit evenement zal aanleiding geven tot een daling van de rode fluorescentie van individuele deeltjes. Ten slotte is de geïntegreerde fluorescentie van een pH-gevoelige fluorofoor dat is ingebed in het doel membraan rapporten over de exacte tijd van de pH-daling.
Van de drie fluorescentie-tijd sporen, kunnen alle belangrijke gebeurtenissen (pH-daling, lipide mengen op hemifusion, content mixen op poriën vorming) nu worden gewonnen op een eenvoudige wijze en voor elk deeltje afzonderlijk. Door het verzamelen van de verstreken tijd voor de verschillende overgangen voor veel individuele deeltjes in histogrammen, kunnen we de levens van de bijbehorende tussenproducten. Zelfs verborgen tussenproducten die niet beschikken over een directe fluorescerende waarneembare kunnen direct worden gevisualiseerd uit deze histogrammen.
Protocol
Glazen afdekplaat slip functionalisering
De vlakke dubbellaag gebruikt in de fusion-test wordt ondersteund op een gehydrateerde film van dextran. Dextran fungeert als een spacer tussen de vlakke bilaag en glazen oppervlak. Dit voorkomt dat membraan componenten van steeds vast op het glas oppervlak en biedt ook ruimte aan waarin de inhoud van een virusdeeltje kan ontsnappen na fusie. Dekglaasjes worden gefunctionaliseerd door middel van een behandeling met een epoxy silaan, die ons in staat stelt om chemische binding dextran aan het glas (Elender, et al.. 1996).
- Schik 25 mm dekglaasjes in een keramische vlekken rack, en....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De voorbereiding van vocht en continue ondersteund lipidendubbellagen kan een uitdaging zijn. Sporen van verontreinigende materiaal of oppervlak fouten zal voorkomen dat de verspreiding van dubbellagen. Zorgvuldige reiniging en afzetting van een uniforme laag van dextran zijn essentieel.
Langdurig beeldvorming van virusdeeltjes kan het bleken van de fluorescente labels of ervoor zorgen dat ze worden geïnactiveerd. Foto-schade van deze soort is bekend in de bio-imaging en single molecule veld.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Het werk werd ondersteund door NIH subsidie AI57159 (tot SCH) en AI72346 (tot AMvO). SCH is een Howard Hughes Medical Institute Investigator.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Corning dekglasvierkantjes, 25 mm | Sigma-Aldrich | CLS286525 | |
| Gefuseerde silica dia's | Technical Glass | ||
| Kleurestatief | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| (3-glycidoxypropyl)trimethoxysilaan | Gelest Inc. | SIG5840.1 | |
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375 | |
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipid, Inc | 700000 | |
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-fosf–thanolamine, triethylammoniumzout (biotine-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | |
| Streptavidine, fluoresceïne-conjugaat | Invitrogen | S-869 | |
| Disialoganglioside GD1a uit runderbrein | Sigma-Aldrich | G2392 | |
| Mini extruder | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| Polycarbonaat membraanfilters 0,1 micron | Whatman, GE Healthcare | 800309 | |
| Afvoerschijven van 10 mm (membraansteunen) | Whatman, GE Healthcare | 230300 | |
| Sulforhodamine b natriumzout | S1402 | ||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | Zie Floyd et al. 2008 voor syntheseprotocol | ||
| PD-10 ontzoutingskolommen | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Nikon fluorescentiemicroscoop | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Plan Apo TIRF 60x 1,45 NA objectief | Nikon Instruments | ||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent Inc. | ||
| Spuitpomp | Harvard Apparatus | 702213 |
Referenties
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
