Para que los lentivirus, los vectores de ADN se transfectadas en células humanas 293. Después de la cosecha y la concentración del sobrenadante, título del virus se determina mediante la expresión de fluorescencia con un citómetro de flujo.
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Artículo de método
Lentivirus de producción
En este artículo
Resumen
Resumen
ARN de interferencia (ARNi) es un sistema de silenciamiento de genes en las células vivas. El ARN de interferencia, en la secuencia de genes homólogos a corto RNAs de interferencia (siRNA) son silenciadas en el estado post-transcripcional. ARN de horquilla corta, los precursores de siRNA, se puede expresar mediante lentivirus, lo que permite el ARNi en una variedad de tipos de células. Los lentivirus, como el virus de inmunodeficiencia humana, son capaces de infectar tanto a la división y que no se dividen las células. Vamos a describir un procedimiento que a los lentivirus paquete. Envase se refiere a la preparación de virus competentes de vectores de ADN. Lentiviral los sistemas de producción de vectores se basan en un 'split' del sistema, donde ha sido el genoma del virus natural de división en las construcciones de plásmido auxiliar individual. Esta división de los diferentes elementos virales en cuatro vectores separados disminuye el riesgo de crear un virus capaz de replicarse por recombinación accidental del genoma del lentivirus. Aquí, un vector que contiene la shRNA de interés y tres vectores de empaquetamiento (p-VSVG, PRSV, pMDL) son transfectadas transitoriamente en 293 células humanas. Después de al menos un período de incubación de 48 horas, el sobrenadante que contiene el virus se recoge y se concentra. Finalmente, título del virus se determina por el reportero (fluorescentes), expresión con un citómetro de flujo.
Protocolo
Parte 1: La transfección de células HEK 293 células para producir lentivirus
* 24 horas antes de la transfección, la placa de 2,5 X 10 6 células en una placa de 10 cm para una confluencia del 50-70% al día siguiente.
- Inicio este protocolo mediante la preparación de ADN con la que uno más tarde transfectar una de las células para hacer virus. En primer lugar, diluir FuGENE 6 Transfección reactivo Roche, un reactivo de los lípidos que componen las células toman el ADN. En un tubo de 1,5 ml, pipeta de 30μl FuGENE 6 en 600ul medio libre de suero (SFDMEM). Tenga cuidado de no dejar que FuGENE tocar la parte del tubo que s....
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Agradecimientos
Sandler Asma Centro de Investigación Básica (SABRE)
Sandler Fundación
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM Células HEK 293T Penicilina-estreptomicina Glutamina Solución salina tamponada con fosfato FBS | Invitrogen | ||
| Reactivo de transfección FuGENE 6 pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG | Roche Group | ||
| Lejía | Clorox | ||
| Placas de cultivo celular de 10 cm Placas de cultivo celular de 96 pocillos | Falcon BD | 353003 | |
| Pipeta multicanal | Rainin | ||
| Puntas de pipeta filtradas | Rainin | ||
| Tubos Eppendorf de 1,5 ml Jeringa Filtro de jeringa (0,45-μm) | Eppendorf | ||
| Tubos para ultracentrífuga | Beckman Coulter Inc. | ||
| Incubadora de cultivo celular al 5 % de CO2 | Coulter | ||
| Rotador Beckman SW41T.I | |||
| Ultracentrífuga Beckman | Beckman Coulter Inc. | ||
| Microscopio fluorescente | Coulter | ||
| FACS Array | Beckman Coulter Inc. |
Referencias
- Reiser, J. Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors. Gene Therapy. , 72-7211 (2000).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
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Reimpresiones y permisos
