Protease प्रतिदीप्त जांच किट का प्रयोग Protease गतिविधि निर्धारित

Summary

Protease प्रतिदीप्त जांच किट protease गतिविधि की माप fluorometry का उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. यह भी protease संदूषण की मात्रा का पता लगाने का पता लगाने के के लिए उपयुक्त है. विधि FITC लेबल कैसिइन सब्सट्रेट के एक मालिकाना सूत्रीकरण के proteolytic hydroysis पर आधारित है.

Abstract

Protease प्रतिदीप्त जांच किट प्रदान करता है तैयार उपयोग protease गतिविधि की उपस्थिति का पता लगाने के लिए अभिकर्मकों. Protease गतिविधि का पता लगाने के लिए यह सरल परख कैसिइन सब्सट्रेट के रूप में उपयोग करता है fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) के साथ लेबल है.

FITC - छोटे टुकड़े, जो अम्लीय शर्तों के तहत नहीं वेग में लेबल कैसिइन सब्सट्रेट की दरार में protease गतिविधि का परिणाम है. Protease नमूना और सब्सट्रेट के ऊष्मायन के बाद, प्रतिक्रिया trichloroacetic एसिड (TCA) के अलावा के साथ acidified है. मिश्रण तो पचाया नहीं सब्सट्रेट एक गोली और छोटे, अम्ल घुलनशील समाधान में शेष टुकड़े के गठन के साथ centrifuged है. सतह पर तैरनेवाला और निष्प्रभावी है FITC लेबल टुकड़े के प्रतिदीप्ति मापा जाता है.

वर्णित किट प्रक्रिया लगभग 0.5 μg / एमएल (trypsin के 5 एनजी परख के लिए जोड़ा) के एक एकाग्रता में trypsin protease नियंत्रण का पता लगाता है. इस संवेदनशीलता एक लंबी ऊष्मायन समय के साथ वृद्धि हुई किया जा सकता है, 24 घंटे तक. परख microcentrifuge ट्यूबों में किया जाता है और प्रक्रियाओं प्रतिदीप्ति या तो cuvettes या multiwell प्लेटों का उपयोग कर पता लगाने के लिए प्रदान की जाती हैं.

Protocol

तैयार निर्देश

ऊष्मायन बफर, परख बफर, और 0.6 एन TCA समाधान के लिए तैयार उपयोग के समाधान के रूप में प्रदान की जाती हैं.

FITC - कैसिइन सब्सट्रेट - यह छोटी मात्रा में दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र से बचने के आगमन पर FITC - कैसिइन सब्सट्रेट विभाज्य करने के लिए सिफारिश की है. यदि FITC - कैसिइन सब्सट्रेट दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र के अधीन है, पृष्ठभूमि में एक मामूली वृद्धि होती है, जिससे, संवेदनशीलता कम. aliquots -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए और प्रकाश से सुरक्षित है. प्रत्येक नमूना, रिक्त, या नियंत्रण प्रतिक्रिया FITC - कैसिइन सब्सट्रेट के 20 μl की आवश्यकता है. रुक / के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पिघलना जोरदार मिश्रण या मिलाते FITC एक उच्च पृष्ठभूमि पढ़ने और कम सब्सट्रेट protease दरार के लिए उपलब्ध है के कारण में जिसके परिणामस्वरूप कैसिइन से अलग करने के लिए पैदा कर सकता है.

Fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) नियंत्रण समाधान FITC नियंत्रण परख बफर में उचित एकाग्रता के लिए पुनर्गठित किया जा सकता है. यह समाधान ताजा किया जाना चाहिए और प्रकाश से रक्षा की.

अंतिम trypsin नियंत्रण समाधान trypsin, Protease नियंत्रण (टी 6567 उत्पाद कोड) की शीशी 1 मिमी एचसीएल के 100 μl जोड़ें. संक्षिप्त मिक्स सुनिश्चित trypsin भंग कर रहा है. ऊष्मायन बफर के 900 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से. वैकल्पिक रूप से, अन्य बफ़र्स अगर परख के लिए वांछित इस्तेमाल किया जा सकता है. trypsin के अंतिम कार्य एकाग्रता 20 μg / μl है. जब trypsin नियंत्रण समाधान तैयार करने के लिए तैयार, ऊष्मायन बफर (भाग 1 acidified 9 भागों बफर करने के लिए trypsin) की सही राशि के साथ अम्लीय trypsin समाधान के एक विभाज्य गठबंधन. अम्लीय शर्तों के तहत trypsin भंडारण trypsin की स्थिरता बढ़ जाती है. trypsin नियंत्रण समाधान तापमान संवेदनशील है और कम मात्रा में स्थिर नहीं है.
किट इन तैयार समाधान के भंडारण और स्थिरता के लिए तकनीकी बुलेटिन की समीक्षा करें.

प्रक्रिया

1. यह आसान नियंत्रण, कारतूस, और नमूने एक समय में सब तैयार है. प्रत्येक नमूने के परीक्षण के लिए, एक microcentrifuge ट्यूब के लिए ऊष्मायन बफर के 20 μl, FITC कैसिइन सब्सट्रेट के 20 μl, और नमूने के परीक्षण 10 μl जोड़ें. उच्च protease गतिविधि के साथ परीक्षण के नमूने के लिए, नमूना कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकता है.
2. उचित नियंत्रण नमूने (नियंत्रण नमूने देखें) एक microcentrifuge ट्यूब के लिए ऊष्मायन बफर, FITC कैसिइन सब्सट्रेट के 20 μl, और नियंत्रण नमूना के 10 μl के 20 μl जोड़कर तैयार करें.
3. एक microcentrifuge ट्यूब के लिए ऊष्मायन बफर, FITC कैसिइन सब्सट्रेट के 20 μl, और ultrapure पानी की 10 μl के 20 μl जोड़कर एक खाली नमूना तैयार.
4. धीरे 37 ° 60 मिनट के लिए अंधेरे में सी पर प्रत्येक ट्यूब और सेते मिश्रण. भी सख्ती नहीं मिश्रण, के रूप में अत्यधिक अशांति उच्च प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि के कारण हो सकता है और परख की संवेदनशीलता को कम करने के लिए सावधान रहें.
   नोट: ऊष्मायन समय 24 घंटे तक बढ़ाया जा सकता है संवेदनशीलता को बढ़ाने. 24 घंटे से अधिक नहीं के रूप FITC - कैसिइन को नीचा दिखाना शुरू कर सकते हैं सावधान रहो, उच्च प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि करने के लिए अग्रणी.
5. ऊष्मायन के बाद 0.6 एन Trichloroacetic एसिड प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब के लिए समाधान के 150 μl जोड़ें. TCA बहुत संक्षारक है और उचित सुरक्षा उपकरण पहने हुए नियंत्रित किया जाना चाहिए.
6. धीरे मिश्रण और 37 पर सेते ° सी 30 मिनट के लिए अंधेरे में.
7. 10,000 एक्स जी पर 10 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला अम्ल घुलनशील, FITC लेबल टुकड़े होते हैं और प्रतिदीप्ति माप के लिए इस्तेमाल किया जाता है.

प्रतिदीप्ति माप

इन तरीकों को बढ़ाया जा सकता है या नीचे उपलब्ध इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकताओं के अनुसार. उचित नियंत्रण के नमूनों के साथ एक मानक तैयार वक्र की तुलना के लिए, प्रत्येक नमूने के परीक्षण मान (FLUtest) से रिक्त नमूने (FLUblank) के प्रतिदीप्ति पढ़ने घटाना.

Cuvettes

1. पिपेट सतह पर तैरनेवाला (चरण 7) और एक उपयुक्त क्युवेट में परख बफर के 1 मिलीलीटर के 10 μl और धीरे मिश्रण. नोट: सतह पर तैरनेवाला और परख बफर के समाधान 2-8 ° सी में अंधेरे में संग्रहीत किया जा सकता है 24 घंटे पहले प्रतिदीप्ति मापने के लिए.
2. उत्तेजना के साथ 485 एनएम प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकार्ड और 535 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन की निगरानी.

Multiwell प्लेट्स

1. सतह पर तैरनेवाला (चरण 7) और एक उपयुक्त ट्यूब या शीशी में परख बफर की एक मिलीलीटर और धीरे मिश्रण के पिपेट 10 μl: सतह पर तैरनेवाला और परख बफर के समाधान 2-8 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में अप के लिए भंडारित किया जा सकता है प्रतिदीप्ति मापने से पहले 24 घंटे के लिए.
2. एक काले रंग की 96 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से 200 μl स्थानांतरण. उत्तेजना के साथ 485 एनएम प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकार्ड और 535 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन की निगरानी.
   या

1. पिपेट सतह पर तैरनेवाला के 2 μl (चरण 7) और परख बी के 200 μlएक काले रंग की 96 अच्छी तरह से थाली के एक कुएँ में uffer. नोट: सतह पर तैरनेवाला और परख बफर के समाधान 2-8 ° सी में अंधेरे में संग्रहीत किया जा सकता है 24 घंटे पहले प्रतिदीप्ति मापने के लिए.
2. उत्तेजना के साथ 485 एनएम प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकार्ड और 535 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन की निगरानी.

नियंत्रण नमूने

Trypsin नियंत्रण समाधान पुष्टि परख ठीक से प्रदर्शन कर रहा है, पता लगाने सीमा निर्धारित करते हैं, या एक सामान्य मानक वक्र बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक अलग, विशिष्ट protease की परख के लिए, यह एक नियंत्रण उचित ऊष्मायन बफर में विशिष्ट protease युक्त समाधान तैयार करने के लिए सिफारिश की है.

परख का पता लगाने की सीमा protease की राशि है कि रिक्त नमूने के साथ प्राप्त मूल्य से ऊपर एक महत्वपूर्ण प्रतिदीप्ति पढ़ने का उत्पादन है. पता लगाने की सीमा इंस्ट्रूमेंटेशन के संवेदनशीलता के आधार पर अलग अलग होंगे. Trypsin नियंत्रण समाधान के सीरियल dilutions नियंत्रण समाधान उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

एक पढ़ने रिक्त नमूने के साथ प्राप्त मूल्य के 120% के बराबर महत्वपूर्ण माना जाता है. नियमित, trypsin के 5 एनजी का पता लगाने के की सीमा इस प्रक्रिया के साथ प्राप्त किया गया था. यह अनुशंसा की जाती है कि कम से कम 5 एनजी trypsin नियंत्रण प्रत्येक परख के साथ चला जा. 0.5 μg / एमएल के एक एकाग्रता के साथ एक trypsin नियंत्रण समाधान परख में वांछित trypsin के 5 एनजी पर नतीजा होगा. Trypsin नियंत्रण समाधान (20 μg / मिलीलीटर) एक 0.5 नियंत्रण / μg मिलीलीटर समाधान, यानी एक हिस्सा trypsin नियंत्रण ऊष्मायन बफर के 39 भागों के लिए समाधान के परिणामों में 40 गुना के एक कमजोर पड़ने.

चित्रा 1 (trypsin गतिविधि का मानक वक्र): trypsin नियंत्रण समाधान (20 μg / मिलीलीटर) भी धारावाहिक dilutions करके एक मानक वक्र उत्पन्न (चित्रा 1 देखें) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रत्येक नियंत्रण नमूने के प्रतिदीप्ति पढ़ने रिक्त नमूने के प्रत्येक नियंत्रण नमूने (FLUcontrol) के मूल्य से प्रतिदीप्ति (FLUblank) पढ़ने subtracting द्वारा सही किया गया था.

Trypsin (उत्पाद कोड टी 6567) के लिए विशिष्ट मानक वक्र इस किट का उपयोग और नियंत्रण के नमूने 0.15 μg / एमएल (1.5 एनजी) से 2.5 μg / मिलीलीटर (25 एनजी) को लेकर. इस वक्र वर्णित प्रक्रिया का पालन करके चरण 4 के लिए 30 मिनट की एक ऊष्मायन समय के साथ उत्पन्न किया गया था. प्रतिदीप्ति माप एक multiwell थाली में किए गए थे.

Fluorescein आइसोथियोसाइनेट संभव साधन अंशांकन के लिए एक नियंत्रण (उपयुक्त है निर्माता के निर्देशों को देखें) या FITC संकेत के linearity रेंज के निर्धारण के रूप में प्रदान की जाती है.

Discussion

हम सिर्फ एक उदाहरण परख दिखाया है Protease प्रतिदीप्त जांच किट का उपयोग करने के लिए एक जैविक नमूने में protease गतिविधि का पता लगाने. इस किट शारीरिक अनुप्रयोगों में पाया proteases की एक विविध रेंज का पता लगाने के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है. यह सेरीन, सिस्टीन, metallo, और एसपारटिक proteases का पता लगाने के के लिए उपयुक्त है, तथापि, संशोधनों के कुछ विशिष्ट proteases का पता लगाने के लिए आवश्यक हो सकता है है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease Fluorescent Detection Kit	Sigma-Aldrich	PF0100
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H1758