L'isolamento e la derivazione di cellule embrionali del mouse Germinal

Summary

La capacità di cellule germinali embrionali di differenziarsi in cellule germinali primordiali durante le prime fasi di sviluppo è un modello perfetto per affrontare la nostra ipotesi sul cancro e la sterilità. Questo protocollo mostra come isolare le cellule germinali primordiali di gonadi in via di sviluppo 10,5-11,5 embrioni giorni post coitum mouse.

Abstract

La capacità di cellule embrionali germinali (EG) a differenziarsi in cellule germinali primordiali (PGC) e più tardi in gameti durante le prime fasi di sviluppo è un modello perfetto per affrontare la nostra ipotesi sul cancro e la sterilità. Questo protocollo mostra come isolare le cellule germinali primordiali di gonadi in via di sviluppo 10,5-11,5 giorni post coitum (DPC), embrioni di topo. Lo sviluppo di creste delle gonadi da embrioni di topo (C57BL6J) erano dissociate dalla rottura meccanica con collagenasi, poi placcato in uno strato di fibroblasti di topo alimentatore embrione (MEF-CF1) che precedentemente era mitoticamente inattivati ​​con mitomicina C in presenza di mezzi di comunicazione ad eliminazione diretta e integrata con Inibitore leucemia Factor (LIF), fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF), e Stem Cell Factor (SCF). L'utilizzo di questi metodi di ottimizzazione per l'identificazione PCG, l'isolamento, e la creazione di condizioni di coltura permette di culture a lungo termine delle cellule EG per più di 40 giorni. Le linee sulle cellule germinali hanno mostrato fenotipo embrionale ed espressione di marcatori comuni usati dello stato pluripotente. L'isolamento e la derivazione di cellule germinali in coltura fornire uno strumento per comprendere il loro sviluppo in vitro e offrono la possibilità di monitorare i danni cumulativi a livelli genetici ed epigenetici dopo l'esposizione allo stress ossidativo.

Protocol

Parte 1: Laparotomia mouse in gravidanza

1. Utilizzando dislocazione cervicale, l'eutanasia un topo gravide C57BL6J femminile a 10,5-11,5 dpc.
2. Pulire l'addome con sapone antimicrobico, e poi, radersi.
3. Dopo la rasatura, lavare l'addome con una soluzione salina.
4. Poi, a secco l'addome con una garza sterile.
5. Coprire il mouse con un nuovo campo sterile.
6. Effettuare una incisione ventrale con pinze e forbici dissezione.
7. Identificare e rimuovere l'utero intero dalla cavità addominale. Embrioni di topo saranno visibili all'interno dell'utero.
8. Trasferire l'utero in una scatola Petri riempite con D-PBS, e tenerlo in ghiaccio.
9. Usando un bisturi sterile e pinzette, rimuovere la placenta ed extra tessuti embrionali di ogni embrione.
10. Trasferire gli embrioni in un piatto fresco Petri riempite con D-PBS.
11. Misurare la lunghezza della embrioni di topo. Abbiamo scoperto che le dimensioni differiscono in base all'età dell'embrione. Per esempio 8,5 dpc misurata a una media di 6 millimetri, 10.5 dpc misurata a una media di 11mm, e 12,5 dpc misurato ad una media di 16 mm.
12. Quindi, rimuovere la coda per l'estrazione del DNA.

Parte 2: dissezione Ridge gonadica

Sotto stereomicroscopio e Sorgente Schott Fostec

1. Inserire una carta da filtro in una capsula di Petri. Poi, posto l'embrione del mouse sulla parte superiore del filtro di carta per asciugare l'embrione e immobilizzare per la dissezione.
2. Usando un bisturi sterile, praticare un taglio trasversale dell'embrione mouse sopra l'origine del cordone ombelicale.
3. Sotto uno stereomicroscopio, utilizzando una pinza sottile sterile e un ago sterile presa in giro fine, rimuovere l'intestino ed il fegato in modo che il sistema urinario è visibile.
   I reni sono situati lateralmente nella cavità addominale, e la vescica si trova mediale e caudale rispetto ai reni. L'embrione può essere identificato come maschio, perché le creste delle gonadi sono situate su entrambi i lati della vescica. Nella femmina, le creste delle gonadi sono saldamente attaccati alla fine caudale laterale dei reni.
4. Sbucciate la cresta gonadica fuori facendo scorrere un ago dietro. La cresta gonadica viene rimosso tagliando via i tessuti che lo supportano.
5. Trasferire le creste delle gonadi di un nuovo piatto di Petri riempite con nuove D-PBS.
   Microscopicamente, la cresta delle gonadi maschili dovrebbero essere spogliati, di grandi dimensioni e di forma ovale. Al contrario, la cresta delle gonadi femminili devono essere individuati, hanno forma allungata ed essere più piccole rispetto alla cresta delle gonadi maschili.

Parte 3: Digestione Ridge gonadica

Sotto stereomicroscopio:

1. Mesonefro Dissection: Separare i gonade dal mesonefro e la cresta con un ago sottile e tagliente.
   • E 'importante rimuovere il mesonefro dalla cresta gonadica, perché è un tessuto somatico che invadere nel processo di derivazione PGC.
2. Digestione Ridge gonadica: Raccogliere pulito creste gonadico in una goccia di fresca 0.5ul D-PBS. Aggiungere 20 ml di Collagenasi / dispasi soluzione (concentrazione finale a 1mg/ml).
   • Gli embrioni devono essere trattati singolarmente. Ogni embrione deve avere il proprio piatto a parte ed etichettato Petri.
3. Gonadica Ridge tritare: Tagliare la cresta gonadica in piccoli pezzi con un ago sterile e sterile una pinza sottile No. 4.
4. Incubazione: piastre di Petri sono trasferiti in un incubatore a 37 ° C per 15 minuti.
   • Il tempo di incubazione può variare tra i tessuti.
5. Pipettaggio: Dopo 15 minuti, il tessuto può essere dissociato da pipettaggio. Con pipette in vetro tirato capillari con diametri tra 40 mm -100 Rompere i pezzi pipettando su e giù. Questo formerà grumi di piccole dimensioni. Trasferire le macchie di 0,5 ml di un pre riscaldato D-PBS goccia per un lavaggio finale.
6. Dopo il lavaggio, trasferire i grumi di tubi eppendorf.
   • Non più di esporre il tessuto di collagenasi.
   • Non fare una sospensione singola cellula. Questo è importante per la formazione di colonie. Se si tratta di una sospensione di cellule singole, PGC tendono a differenziare e migrazione.
   • Questo processo non dovrebbe essere più di 20 minuti, o le cellule perdono vitalità.
7. Centrifugare a 2000 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente.
8. Dopo centrifugazione, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 0,5 ml di bussare integrato fuori media (pre-riscaldata a 37 ° C).

Parte 4: Primordiale Cultura Germinal Cellule

"È necessario effettuare i seguenti passi in fretta per conservare la vitalità di PGC per l'isolamento e la derivazione.

1. 24 ore prima di questo processo si dovrebbe preparare un mitoticamente inattivato MEF-CF1 alimentatore strato seguendo il protocollo di J. Zhang et al 2008.
   • Preparare 20 piatti per uno pregnant femminile del mouse (6-8 embrioni).
   • MEF perdono la capacità di essere uno strato alimentatore (promuovere la crescita e prevenire differenziazione) dopo 5-6 passaggi.
   • Non utilizzare più di 48 ore MEF.
2. Immediatamente prima PGC placcatura, il mezzo MEF deve essere lentamente dallo strato alimentatore MEF.
3. Quindi, aggiungere 0,5 ml / pozzetto di pre-riscaldato medio knockout integrata sullo strato alimentatore MEF.
   • MEF supporto contiene siero fetale bovino, che induce la differenziazione di PGC.
   • Medio knockout deve essere integrato con specifici fattori di crescita specie immediatamente prima dell'uso per assicurare l'attività del fattore di crescita.
4. Utilizzando distribuzione simmetrica, PGC piatto sopra lo strato alimentatore MEF.
   • Se questi pezzi sono troppo vicini, tendono ad aggregarsi e fare dense colonie che si attaccano male o iniziare differenziazione.
   • Piatti di cultura devono essere etichettati con nome embrionali Germinal linea cellulare, il numero di passaggio, e la data.
5. Cura, il trasferimento i piatti della cultura in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO _2.
6. Monitorare le cellule ogni 24 ore.
7. Dopo 48 ore, togliere 250 ml di mezzi di comunicazione dalla cima della cultura per non disturbare l'attaccamento della colonia. Quindi, aggiungere 250 ml di fresca integrato knock-out dei media (pre-riscaldato a 37 ° C).
8. Dopo il punto 7, attendere altre 48 ore, e poi, rimuovere completamente tutti i media e sostituirlo con fresca dei media integrato knock-out (pre-riscaldato a 37 ° C). Fate questo ogni 2 giorni per 8-10 giorni fino a formare PGC colonie.

Parte 5: cellule germinali embrionali

1. Dopo 10 giorni di isolamento PGC, colonie cellula germinale embrionale si formano.
2. Linee di cellule embrionali germinali sono tenuti in vita da passaggi manuali ogni 8-10 giorni. Essi continuano a presentare una morfologia indifferenziata ed esprimere marcatori pluripotenza come alcalino fosfatasi, Oct-4, SSE-1, e SOX-2

Note

• Condizioni di sterilità / asettiche sono essenziali nella sala della cultura.
• Per la derivazione e la cultura, PGC sono trattati in classe di sicurezza II purificatore Cabinet Bio.
• Incubazioni sono in un umidificata 37 ° C e 5% CO ₂ incubatore.
• Tutti i media ei reagenti vengono filtrati prima di utilizzare in un filtro di 0,2 um, conservato a 4 ° C, e pre-riscaldato a 37 ° C prima dell'uso.
• Durante le fasi di dissezione, tutti gli embrioni e tessuti deve essere tenuta in ghiaccio.
• Tutti i flaconi dei reagenti sono decontaminati con etanolo prima di mettere in un armadio.
• Uso di guanti, camice da laboratorio, e tappi infermiere sono obbligatori.

Conclusione

Abbiamo fornito un video che mostra come isolare, derivano, e la cultura cellule embrionali germinali da creste delle gonadi di embrioni di topo 10,5-11,5 dpc. L'isolamento riproducibile e la cultura a lungo termine di linee di cellule embrionali germinali fornisce una base fondamentale per lo studio dello sviluppo embrionale precoce, i modelli germinali genetiche ed epigenetiche, la formazione delle gonadi, gli effetti ambientali di organi circostanti durante il processo di sviluppo della gametogenesi negli embrioni maschili e femminili, e la determinazione di percorsi che porta al cancro e la sterilità.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10.5 - 11.5 dpc pregnant C57BL6J female mouse crossed with the same background male mouse.
Mouse Fibroblast MEF-CF1 ATCC		SCRC-1040
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Invitrogen	14190/086
Collagenase /Dispase Solution	Roche Group	269638
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Mitomycin C	Sigma-Aldrich	M4287
Trypsin EDTA	Invitrogen	25200-072
MEF Medium: Dulbecco Medium Eagle Modified (D-MEM) GLUTAMAX High glucose	Invitrogen	10566024
10% Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16000/044
1% of antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15420/096
Knockout Media: 80% knockout D-MEM	Invitrogen	10829/018
20% Knockout serum Invitrogen Cat. No. 1028/028, 200mM L-glutamine Invitrogen		25130/081	with β-mercapt–thanol Sigma Catalogue Number: M7522
1X non essential amino acid solution	Invitrogen	11140/050
1% antibiotic-antimycotic	Invitrogen	15420/096	supplemented with grow factor as 2500 U of Leukemia inhibitory factor (mLIF-ESGRO) Millipore Catalogue Number: ESG1106
40 ng/ml of Recombinant Murine Stem Cell Factor (SCF) ReproTech		250-03
20 ng/ml of Basic Fibroblast Growth factor (bFGF)	Invitrogen	13256-029
Corning center well culture dish 60mm	Fisher Scientific	07-200-79	1.5 ml eppendorf tube, and 15 ml falcon tubes
Forceps No. 14 and 15, scalpel 35 mm, dissection scissors, surgical fields, antimicrobial soap, saline solution 0.9 %, gauze, ice foam container, razor blade, scalpel 35 mm, fine forceps No. 4 and 5, fine teasing needle with handle, filter paper sheets, and pulled glass pipettes. Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.
Equipment: dissecting stereomicroscope, light source Schott Fostec, inverted microscope, micropipette 10 and 200ul, centrifuge, bio safety Cabinet.