Summary
Декстран сульфата натрия (DSS) вводят в питьевой воде является признанным мышиной модели воспалительных травмы острого колита. Этот протокол описывает метод для DSS лечения и подготовки ткани.
Abstract
Колит может быть вызван вирусной или бактериальной инфекции, ишемический инсульт, или аутоиммунные расстройства, особенно неспецифический язвенный колит и толстой вариант Болезнь Крона - Колит Крона. Острого колита могут проявляться болями в животе и вздутие живота, нарушение всасывания, понос, Hematochezia и слизи в стуле. Мы начинаем понимать сложные взаимодействия между окружающей средой, генетики и эпителиального барьера в дисфункция Воспалительные заболевания кишечника и животных моделях колита, сыграли существенную роль в продвижении нашего понимания этого заболевания. Один из популярных моделей не предусматривает дополняющие питьевой воды мышей с низкой молекулярной массой декстран сульфата натрия (DSS), что приводит к повреждению эпителия и надежный воспалительную реакцию в толстой кишке в течение нескольких дней
Protocol
Часть 1: Травма-Ремонт колит модели
- Базовый вес должен быть получен для каждой мыши до начала лечения DSS.
- Сделайте 3% (м / о) Декстран Сульфат натрия Солевой раствор в воде и фильтр с 0,45 мкм фильтр из ацетата целлюлозы.
- Замените питьевую воду в клетке мыши с 3% DSS решение в течение четырех дней. Мышей не должны иметь доступ к любому другому источнику воды (т.е. советы исключения размещены на автоматизированные системы полива).
- На четвертый день, замените DSS раствор водой в течение еще трех дней, что позволило некоторым толстой эпителиальных восстановления. Мышей должна быть взвешена на четвертый день для того, чтобы количественно системные последствия колита. Потеря веса общего с серьезной травмой.
- На 7-й день, взвесить и жертвы мышей. Мыши могут быть умерщвлены путем ингаляционного передозировки изофлуран или другие институционально IACUC утвержденными методиками.
Часть 2: вскрытие и уборки Колон
- Expose брюшной стороне мыши и безопасной ноги для обеспечения беспрепятственного доступа к животу. Влажные живота полностью с 70% этанола.
- Возьмитесь средней линии живота с тканью щипцы и расширить вверх таким образом места для палаток кожи. Используйте с острым концом ножниц надрезать брюшко тем самым подвергая содержимого брюшной полости. Расширение Разрез до кончика xyphoid процесс в средней линии, а затем распространяется вдоль нижней аспект прибрежных полей на двусторонней основе.
- Определить тонкой кишки, слепой кишки и толстой кишки. Осторожно рассекают / дразнить толстой кишки с окружающими брыжейки. Трансекта толстой кишки в глубине таза, чтобы освободить дистальной толстой и прямой кишки. Трансекта толстой кишки на colonocecal маржу, чтобы освободить проксимальных толстой кишки. Необходимо соблюдать осторожность во время этого процесса, чтобы не повредить толстую кишку, как очистка толстой кишки будет проблематично, если перфорация происходит.
- Использование 20G игла кормления и 10 мл шприца, интубация и промойте толстой ледяной PBS до элюата совершенно ясно, кала.
- На данный момент, если макроскопического анализа с рассекает микроскопом желательно, двоеточия может быть зафиксирован как "колбаса". Если гистологический анализ только желательна, чем приступить к Части 4 «Создание швейцарских Валки для гистологического анализа острого колита".
Часть 3: Обработка как "Колбасы" для макроскопических Анализ всей толстой кишки
- Очень важно поддерживать правильную ориентацию толстой кишки, поэтому держать дистального конца толстой кишки ближе к оператору. Отрежьте два куска, не рассасывающиеся нити (SP116 1,5 метрический плетеные шелковые), один около 1 дюйма в длину, другие 2 дюйма.
- Использование 2-дюймовый кусок шва, чтобы связать с дистального конца как можно ближе к краю, как возможно, сохраняя хорошее уплотнение.
- Место 20G иглу кормления, содержащий 5 мл 10% буферный формалин фосфата в проксимальном конце толстой кишки. Свободно галстук оставшийся кусок шва сразу проксимальнее луковица кормления иглы. Возьмите толстую кишку твердо на луковицу кормления иглы и настаивать формалина до толстой кишки расширена. Затяните узел на шов, как вы снять кормления иглой, оставляя таким образом переплетаются, расширение толстой кишки, как "колбаса".
- Заполнить 15 мл коническую трубку с 10% буферный формалин фосфата и место двоеточия в трубку. Fix течение 24 часов.
- Вылейте формалина и заменить 70% этанола для дополнительных 24 часов. (Двоеточие могут быть сохранены в 70% этанола на неопределенное время при комнатной температуре.)
- Удалить из толстой кишки конической трубе и сократить строки на каждом конце с помощью скальпеля, соблюдая осторожность, чтобы не повредить толстую кишку. Помните, что дистальный конец имеет самую длинную веревочку. Вырезать продольно от дистальной к проксимальной конце толстой кишки, так что он образует длинный лист. На данный момент, толстой кишки можно рассматривать под микроскопом вскрытии.
Часть 4: Создание швейцарских Валки для гистологического анализа острого колита
- Очень важно поддерживать правильную ориентацию толстой кишки, поэтому держать дистального конца толстой кишки ближе к оператору.
- Измерьте длину толстой кишки. Этот показатель является еще одним показателем тяжести травмы. Колит увеличивается отек и сокращает общую длину толстой кишки.
- Использование с острым концом ножниц, надрезать продольно от дистальной к проксимальной конце толстой кишки. Использование тонкой наконечником захватить пинцетом или края разреза и открытой с боков продвигаясь дистально-> проксимально, демонстрируя тем самым толстой кишки в виде плоского листа.
- Роллинг толстой кишки необходима пара щипцов и двуручным техники. Возьмите любого края дистального края щипцами. Приступить к последовательно рулон толстой кишки поворотом и выпуская щипцов перейти к проксимального края. Таким образом генерации спираль с третьим измерением, или "швейцарской ролл".Для поддержания формы проката, держитесь крепко ролл пинцетом и разрез ее 27G1 / 2 иглы. Безопасные иглы, согнув иглу при выходе из рулона.
- Место обвалять в соответствующей маркировкой кассет ткани и поместите в банку с 10% буферный формалин фосфата при комнатной температуре в течение 24 часов, чтобы обеспечить фиксацию ткани.
- Вылейте формалина и заменить 70% этанола для дополнительных 24 часов. (Двоеточие могут быть сохранены в 70% этанола на неопределенное время при комнатной температуре.)
- Как только образец был зафиксирован, он может быть парафин, секционные и установлен на салазках для гистологического анализа.
Часть 5: Представитель Результаты
DSS модель для острого колита позволяет исследователю получать, фиксировать и анализировать толстой кишки, что модели острого колита. Когда рулет режется и монтируется, она должна стать представителем кусочек всей толстой кишки, если проката должным образом (рис. 1). Установлен рулон могут быть окрашены с H & E для того, чтобы определить степень повреждения толстой кишки, от дистальной (внутри) конец проксимальных (снаружи) концом (рис. 2). Immunohistochemistry также может быть выполнена на рулет для идентификации и количественного определения воспалительных инфильтратов. Если колбаса метода была выполнена правильно, фиксированный толстой кишки будут расширены и всей поверхности слизистой оболочки можно легко манипулировать и рассматривать под микроскопом рассечение (рис. 3).
Рисунок 1. Должным образом выполнены "рулет". (А) толстой кишки выпадает из дистальнее проксимального конца, пересекаются с иглой и обеспеченные изгиба конца иглы. Он помещается в ткань кассеты для фиксации. (B) H & E 5 мкм окрашивали разделе рулет из толстой кишки мышей получавших DSS (D = дистальной толстой кишки р = проксимальных толстой кишки).
Рисунок 2. DSS рассматриваются двоеточия проявлять признаки острого колита. Воспаление и склеп повреждения проявляются в DSS обработанных толстой кишки по сравнению с воды, обработанной контроля.
Рисунок 3. Пример "колбаса". Колбасы придают с формалином и полностью расширен. Небольшим углом будет присутствовать вторичной по отношению к естественной кривизны толстой кишки. Открыл колбасы должны сохранять плоскую форму.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол может быть изменена для модели острого повреждения, травмы, ремонт, или хронические процессы толстой травмы.
Модификация острого травматизма:
DSS лечения импровизировать в течение 4-6 дней, после чего немедленно жертвы
Травма-Ремонт изменения:
Травма с 4-6 дней лечения DSS затем восстановительный период в 3-4 дня и жертвы (как описано выше в протокол).
Хронический колит Модификация:
Мыши размещены на трех пятидневного цикла 3% DSS с шестнадцати дней восстановления между каждым циклом. Мыши были принесены в жертву после финального 16-дневный период отдыха.
Есть несколько вопросов, которые исследователи должны быть осведомлены о данной модели:
- Изменчивость в месте повреждения: в наших руках, мы видим, преимущественно дистального травмы узором, с относительной скуп на проксимальных толстой кишки и слепой кишки. Другие страны сообщили о более проксимальных преобладание на травму узор.
- Экологическая изменчивость. Существует значительная изменчивость окружающей среды. Это, вероятно, отчасти, из-за различия в микрофлоре кишечника, диету и другие экологические соображения.
- Эта модель является неэффективной, если высоким молекулярным весом DSS используется (т.е. 500 000 Da).
- Существует значительная вариабельность напряжение с этой моделью 4.
Биохимический анализ толстой кишки может быть выполнено путем взятия проб из проксимальных или дистальных краев. В зависимости от тяжести травмы это может повлиять на вашу способность генерировать гистологические оценка травмы. В естественных условиях BrdU маркировки для измерения распространения может быть достигнуто при введении препарата в 16,7 мкг / кг BrdU 2 часа до жертву затем α-BrdU IHC обработки.
В качестве альтернативы "колбаса", толстой кишки может быть установлена совершенно плоским. Линия нижней части контейнера с Tupperware ватмане и замочить бумагу с 10% буферный формалин фосфата. Рассеките толстой кишки, как описано в "Часть 2: вскрытие и уборки Колон". Опять же, держать дистального конца толстой кишки ближе к оператору. Использование с острым концом ножниц, надрезать продольно от дистальной к проксимальной конце толстой кишки. С тонкой наконечником щипцы понять любого края разреза и открытой с боков работает, демонстрируя тем самым толстой кишки в виде плоского листа. Передача этого плоского листа, чтобы предварительно пропитанной ватмане. Обложка плоский толстой кишки с другой частью ватман и мокрым от 10% буферный формалин фосфата. Ватман должна быть полностью покрыта в формалине, но не так сильно, что она взлетает толстой кишки. Печать Tupperware и исправить в течение 24 часов. Удалить из толстой Tupperware и поместить его в 10 мл 70% этанола в 15 мл коническую трубку. (Двоеточие могут быть сохранены в 70% этанола на неопределенное время при комнатной температуре.)
Есть несколько методов для количественного толстой травмы 5,6,7. Один из методов, например, использует многопараметрические масштаба в том числе: воспаление, степень участия, регенерация, склеп повреждения, и процент участия 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными Вандербильта IACUC.
Acknowledgments
Финансовые средства, предоставленные NIH (1 K08 DK080221-01) и Вандербильт институциональных фондов развития.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran Sulfate Sodium Salt | USB Corp., Affymetrix | 9011-18-1 | mol wt 40,000-50,000 |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC 57319-474-06 | |
| TISSUE PATH Macrosette Cassettes | Fisher Scientific | 15182706 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Ethyl Alcohol | Pharmco-AAPER | E190 | Dilute to 70% with distilled water |
| 20G Straight Feeding Needle | VWR international | 20068-612 | |
| 27G1/2 PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 305109 | |
| Dissecting Scissors Sharp/Blunt Tip | VWR international | 82027-588 | |
| Waugh Forceps | VWR international | 82027-428 | |
| Non-absorbable Suture | LOOK Surgical | SP116 | |
| Whatman Blotting Paper | VWR international | 28298-020 | Cut as needed |
| Nalgene Surfactant-Free Cellulose Acetate (SFCA) Filter | Cole-Parmer | EW-06731-2 | |
| Carbon fiber composites digital caliper | Fisher Scientific | 15-007-958 |
References
- Okayasu, I. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Martinez, J. A. Deletion of Mtgr1 sensitizes the colonic epithelium to dextran sodium sulfate-induced colitis. Gastroenterology. 131 (2), 579-588 (2006).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Mahler, M. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, G544-551 (1998).
- Aharoni, R. Immunomodulatory therapeutic effect of glatiramer acetate on several murine models of inflammatory bowel disease. J Pharmacol Exp Ther. 318 (1), 68-78 (2006).
- Hahm, K. B. Loss of transforming growth factor beta signalling in the intestine contributes to tissue injury in inflammatory bowel disease. Gut. 49 (2), 190-198 (2001).
- Green, B. T. Adrenergic modulation of Escherichia coli O157:H7 adherence to the colonic mucosa. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 287 (6), G1238-1246 (2004).
- Dieleman, L. A. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
