Summary
Dış elektrik alan bir hücre zarı üzerinde bir gerilim indükler kaynaklı membran gerilimi (ΔΦ) olarak adlandırılır. Potansiyometrik boya di-8-ANEPPS kullanarak, noninvaziv ΔΦ ölçmek mümkündür. Bu video ölçmek için protokol gösterir ΔΦ di-8-ANEPPS kullanarak.
Abstract
Yerleştirme harici bir elektrik alanı içine bir hücre zarından bir gerilim, yerel ücret yeniden dağıtılması, hücre zarı çevresindeki, hücre içi ve dışında neden olur. Bu gerilim, bağlı membran gerilimi olarak adlandırılan (de indüklenen transmembran gerilim, ya da uyarılan transmembran potansiyel farkı) ve ΔΦ ile başlar, sadece dış alanda mevcut olduğu sürece var. Membran dinlenme gerilim varsa, indüklenmiş voltaj (ekler) üzerine üst üste bindirir. Di-8-ANEPPS potansiyometrik floresan boyalar, birini kullanarak, hücre zarı ΔΦ varyasyonların gözlemlemek ve noninvaziv değerini ölçmek mümkündür. ΔΦ değişikliği ile orantılı floresan değişimi, hücre zarı çift katlı lipid bağlı di-8-ANEPPS güçlü floresan olur. Bu video ölçmek için protokol ΔΦ di-8-ANEPPS kullanarak gösterir ve aynı zamanda hücre şeklinin genlik ve ΔΦ mekansal dağılımının etkisini gösterir.
Protocol
Bölüm I: Ön adımlar
- Bu deneyde, Çin hamsteri over hücre hattı (CHO-K1) kullanılır. Hücreler,% 8 fetal buzağı serumu ile takviye HAM-F12 kültür ortamında ~ 0.7x10 5 hücre / ml, 0.15 mg / ml Lab-Tek II odaları (2 kuyu, 4 cm 2 Her) (Nalge Nunc, Almanya) kaplanmıştır L-glutamin, 16 mg / ml gentamisin (Sigma-Aldrich, Steinheim, Almanya), 200 adet / ml Crystacillin (Pliva'nın, Zagreb, Hırvatistan), ve 37% 5 CO 2 inkübe ° C Alternatif olarak, hücreler de böyle polylysine gibi hücresel bir yapıştırıcı ile kaplanmış # 1 cam kapak fişleri (kalın 0,13 ila 0,16 mm), kaplama olabilir.
- Hücrelerin kendi kültür ortamında inkübe edin. Kuluçka hala kabaca küresel, ancak kendi zarının küçük bir kısmı ile yüzeye sıkıca bağlı 2 ila 4 saat verimi hücreleri süren. Alternatif olarak, inkübasyon 16 ila 20 saat sonra, hücreler tamamen yüzeye bağlı ve daha karmaşık şekiller var, ama çoğu hala bölünmesi değildir.
- 843 ul DMSO (Sigma-Aldrich, Steinheim, Almanya), orjinal Invitrogen flakon boya, 5 mg ekleyerek di-8-ANEPPS (Invitrogen, Eugene, Oregon, ABD), 10 mM stok solüsyonu hazırlayın. Stok solüsyonu birkaç ay için 4 ° C'de buzdolabında saklanabilir. DMSO kristallerin çözünmesi kadar deneyler başlamadan önce, çözüm ısınmak.
- Bazı hücre dizilerinde hücre zarının içine boya dahil kolaylığı pluronic kullanımı gerekebilir. Pluronic% 20 DMSO (F-127, Invitrogen, Eugene, Oregon, ABD) stok solüsyonu veya DMSO pluronic eriterek tarafından hazırlanan aynı konsantrasyonda bir stok solüsyonu satın alınabilir. Pluronic stok solüsyonu oda sıcaklığında saklanabilir.
Bölüm II: di-8-ANEPPS hücreleri yükleme
- 10 mM di-8-ANEPPS ve Minimum Temel Orta SMEM Spinner değişiklik 1 ml (kalsiyum-tükenmiş sürüm) (orta M8167 ve M4767, Sigma-Aldrich, Steinheim, Almanya% 20 pluronic 2.5 ul 3 ul Mix 1.5 ml Eppendorf tüp). Bu yaklaşık 30 mcM di-8-ANEPPS ve% 0.05 'pluronic içeren bir "yükleme çözüm" ortaya çıkarır. Diğer hücre türleri için, doğdukları kültür ortamı yerine SMEM kullanılabilir.
- Lab-Tek odasında yükleme çözümü ile kültür ortamı değiştirin. 10 dakika boyunca buzdolabında 4 odanın transfer ° C Bu sıcaklık, plazma zarı ile boya içselleştirilmesi büyük ölçüde inhibe edilir.
- Boyama sonra, yavaşça saf SMEM fazla boya ile 2-3 kez yıkayın.
- SMEM odasında 1,5 ml bırakın.
Bölüm III: Deney ve görüntü alımı
- Hücreleri immersiyon yağı hedefi (X63, NA 1.4), monokromatör (Polychrome IV, Visitron, Almanya) ve soğutmalı bir CCD kamera (VisiCam ile donatılmış bir floresan mikroskobu (bizim durumumuzda Zeiss AxioVert 200, Zeiss, Almanya) kullanılarak gözlenmektedir 1280, Visitron, Almanya). MetaFluor 7.1.1 ile elde edilen görüntüleri ve (her ikisi de Moleküler Cihazlar, Downingtown, PA, USA) MetaMorph 7.1.1 işlenmiş, ancak diğer benzer satın alma yazılımı da kullanılabilir. Dalgaboyu 490 nm kazanım yazılım ayarlayın ve örneğin ANEPPS uygun bir emisyon filtresi, 605 nm 'de merkezlenmiş bir bant geçiren filtre (605/55m, dikroik 565 DCXR, Chroma, Rockingham, VT, ABD) seçin. Monokromatör mevcut değilse, 490 nm 'de merkezlenmiş bir harekete geçirici filtre yerine kullanılabilir.
- Odasının altındaki hücreleri mikroskop sahneye odasına yerleştirin, Elektrotların pozisyonu ve darbe jeneratörü bağlayın. Orta elektrotlar kapsamalıdır.
- Hücre canlılığını korumak ve ısıtma azaltmak için, darbe yeterince düşük genlikli ve kısa süreli olmalıdır. Bu deneyde 35 V genlik ve 50 ms süresi (elektroporasyon önlemek için yeterince düşük) sahip bir kare dalga, bir DC gerilim kaynağı ve ısmarlama bir mikroişlemci kontrollü switcher cihaz kullanılarak oluşturulur. Alternatif olarak, 33210A (Agilent, Santa Clara, CA, USA) gibi ticari bir darbe jeneratörü, bir amplifikatör veya S88 (Çimen, West Warwick, RI, ABD) gibi ticari bir uyarıcıdır bağlı kullanılabilir. Darbe, bir elektrik alan elektrotlar ve indükleyici ΔΦ arasında yaklaşık 88 V / cm, 0.8 mm çapında ve 4 mm aralarındaki mesafe iki paralel Pt / Ir tel elektrotlar teslim edilir. Bu deneyde kullanılan elektrot arasındaki alan dağılımı tam olarak başka bir yerde [1] olarak tarif edilir.
- Ilgi hücreleri bulun. Tek bir elektrik darbe veya darbe dizisi uygulayın. : Her darbe için, iki floresan görüntüler elde darbe (kontrol görüntü) hemen önce ve puls (darbe görüntü) sırasında biri. Di-8-ANEPPS düşük tepki nedeniyle, floresan değişiklikler çıplak gözle ayırt ve belirgin onl olmak zordur.işlendikten sonra y. Nabız teslimat kazanım yazılım bir özelliği olan görüntü satın alma, senkronize olmalıdır. Isıtma photobleaching ve olası önlemek için, aydınlatma, darbe süresi ile sınırlı olabilir.
Bölüm IV: Görüntü işleme ve analiz
- MetaMorph yazılım görüntüleri açın. Her darbe için, kontrol ve nabız görüntü hem de arka plan çıkarmak.
- Bir hücre seçin ve membran karşılık gelir, böylece faiz bölgeyi ayarlayın. Floresans şiddetleri kontrol ve nabız resmi bu bölgede boyunca ölçün ve bir elektronik tablo değerleri aktarmak.
- Her darbe için nabız verileri kontrol veri toplama, çıkarma, ve göreli floresan değişiklikleri elde etmek için kontrol verileri sonucu bölmek. Darbe bir dizi uygulanırsa, her darbe için belirlenen göreceli floresan değişikliklerin daha güvenilir bir ölçüm değerleri elde etmek için ortalama olabilir.
- ΔΦ içine bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak göreceli floresan değişiklikler dönüştürün. Bu eğrinin literatürden elde edilen kaba bir tahmin, ama daha yüksek doğruluk için, her kurulum için ölçülebilir. Bu deneyde kullanılan hücreleri ve kurulum için floresan% 6'lık bir azalma ΔΦ [2] 100 mV artışı karşılık gelir.
- Son olarak, göreli yay uzunluğu Excel (Microsoft Corp, Redmond, WA, ABD), Sigma Arsa (Systat Software Inc, San Jose, CA, USA) gibi bir grafik yazılım paketi bir fonksiyonu olarak gerilim arsa, veya Kökeni (OriginLab Corp, Northampton, MA, ABD). Eğrisi de bu hareketli ortalama filtre olarak uygun bir filtre kullanılarak düzeltilmelidir.
Discussion
Kaynaklı membran (transmembran) gerilim, ΔΦ, ölçümleri, membran voltaj kapılı kanallar, aksiyon potansiyeli yayılımı, kardiyak hücre stimülasyonu, hücre zarı elektroporasyon [3, 4, 5, 6 çalışmaları gibi çeşitli deneysel ayarları, önemli olabilir , 7]. Basit hücre şekilleri ile ΔΦ analitik olarak hesaplanabilir. Örneğin, küresel bir hücre için, ΔΦ gerilim alan şiddeti ve hücre büyüklüğü ile orantılı olduğunu belirten ve membran boyunca kosinüs fonksiyonu aşağıdaki Schwan denklemi ile verilir [8, 9]. Daha karmaşık hücre şekilleri için, ΔΦ kosinüsünü önemli ölçüde sapma ve potansiyometrik boya [12, 13, 14, 15], [2, 10, 11], ya da deneysel olarak bir bilgisayar kullanıyorsanız, ya da sayısal olarak tespit edilmelidir.
Bu amaç için yaygın olarak kullanılan potansiyometrik boyaların Bir di-8-ANEPPS (di-8-butil-amino-naftil-piridinium-propil-sülfonat etilen), eksitasyon ve emisyon membran voltaj bağımlı spektrumları ile hızlı bir boya, hücre zarı ve değerini ölçmek için ΔΦ varyasyonları noninvaziv gözlemler sağlar. Bu video, di-8-ANEPPS kullanarak ΔΦ belirlenmesi için deneysel bir yaklaşım gösteriyor.
Boya, Connecticut Üniversitesi Prof. Leslie Loew ve arkadaşları [13, 14] tarafından geliştirilen ve hızlı tepki boyalar sınıf aittir. di-8-ANEPPS su nonfluorescent ve hücre zarı çift katlı lipid içine içermektedir güçlü floresan olur. Intramoleküler yük dağılımı ve boya floresan spektral yoğunluk profili ve ilgili değişiklikler bir değişiklik ΔΦ sonuçlarında bir değişiklik. Di-8-ANEPPS ΔΦ bir değişiklik floresan yoğunluğu ile orantılı olarak değişir; boya yanıt -280 mV ile 250 arasında değişen mV [4, 16] gerilimler için lineer. Bu çabaların da bildirilmiştir [17] olmasına rağmen, boya, düzensiz membran boyanması floresan nispeten küçük değişiklikler, boya ve içselleştirilmesi, di-8-ANEPPS membran gerilimi, örneğin dinlenme bileşeni mutlak ölçümler için daha uygun hale getirmek. Ancak, Uyarılabilir hücreler [4, 5], dış elektrik alanlara maruz kalan nonexcitable hücrelerin kaynaklı membran gerilimi başlangıçlı [12, 13], ya da aksiyon potansiyelleri gibi büyük değişiklikler, membran gerilimi ölçmek için uygundur. Burada uygulanan olmamakla birlikte, di-8-ANEPPS ayrıca, floresan ikaz oranlı metrik ölçümleri ΔΦ belirlenmesi [18] veya emisyon yanıt duyarlılığını arttırır ve yukarıda belirtilen etkilerini azaltır [19]. Di-8-ANEPPS lekeleri membran gibi, aynı zamanda bir zar belirteci olarak sade kullanılan olabilir [2].
Bir boya sakıncaları photobleaching eğilimli olduğunu, bu nedenle güçlü ışık uzun süre maruz kalındığında kaçınılmalıdır. Kalibrasyon boyanın dış ortamda ya (i) potasyum İyonofor valinomycin ve bir dizi farklı potasyum konsantrasyonları ile yapılır [2,18], veya (ii) patch-klemp gerilim kelepçe modunda [17].
Son olarak, küresel hücreleri ve daha karmaşık şekiller hücreleri ΔΦ ölçümleri ile, video ΔΦ genlik ve mekansal dağılımının hücre şekli etkisi göstermektedir. Böylece küresel hücreler için ΔΦ daha karmaşık hücre şekiller için mekansal ΔΦ dağılımı daha karmaşık olmasına rağmen, Schwan denklemi ile anlaşma, bir kosinüs yakın [20] ...
Acknowledgments
Bu çalışma, proje Z2-9229 ve program P2-0249 ile Slovenya Araştırma Ajansı tarafından desteklenmiştir. Bu video "Elektroporasyon tabanlı Teknolojileri ve Tedaviler", Slovenya Ljubljana Üniversitesi Elektrik Mühendisliği Fakültesi tarafından yılda iki kez düzenlenen bilimsel atölye ve lisansüstü ders, ek malzeme temsil eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| di-8-ANEPPS | Invitrogen | D-3167 | potentiometric fluorescent dye |
| pluronic | Invitrogen | P3000MP | potassium ionophore |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| SMEM | Sigma-Aldrich | M8167 or M4767 | Spinner modification of the Minimum Essential Medium |
| Ham-F12 | Sigma-Aldrich | N4888 | culture medium |
| fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| crystacillin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| Lab-Tek II | Nalge Nunc international | 155379 | chamber |
| DC voltage supply | Elektro-Automatik | ||
| microprocessor-controlled switcher | Custom Made | ||
| electrodes | Custom Made | Pt/Ir |
References
- Mazères, S., Šel, D., Golzio, M., Pucihar, G., Tamzali, Y., Miklavčič, D., Teissie, J. Non invasive contact electrodes for in vivo localized cutaneous electropulsation and associated drug and nucleic acid delivery. J. Control. Release. 134, 125-131 (2009).
- Pucihar, G., Kotnik, T., Valič, B., Miklavčič, D. Numerical determination of transmembrane voltage induced on irregularly shaped cells. Annals Biomed. Eng. 34, 642-652 (2006).
- Huang, C. J., Harootunian, A., Maher, M. P., Quan, C., Raj, C. D., McCormack, K., Numann, R., Negulescu, P. A., Gonzalez, J. E. Characterization of voltage-gated sodium-channel blockers by electrical stimulation and fluorescence detection of membrane potential. Nat. Biotechnol. 24, 439-446 (2006).
- Bedlack, R. S., Wei, M., Fox, S. H., Gross, E., Loew, L. M. Distinct electric potentials in soma and neurite membranes. Neuron. 13, 1187-1193 (1994).
- Cheng, D. K. L., Tung, L., Sobie, E. A. Nonuniform responses of transmembrane potential during electric field stimulation of single cardiac cells. Am. J. Physiol. 277, H351-H362 (1999).
- Teissie, J., Eynard, N., Gabriel, B., Rols, M. P. Electropermeabilization of cell membranes. Adv. Drug. Del. Rev. 35, 3-19 (1999).
- Sersa, G., Miklavčič, D. Electrochemotherapy of tumours. JoVE. 22, (2008).
- Kotnik, T., Bobanović, F., Miklavčič, D. Sensitivity of transmembrane voltage induced by applied electric fields a theoretical analysis. Bioelectrochem. Bioenerg. 43, 285-291 (1997).
- Schwan, H. P. Electrical properties of tissue and cell suspensions. Adv. Biol. Med. Phys. 5, 147-209 (1957).
- Gowrishankar, T. R., Weaver, J. C. An approach to electrical modeling of single and multiple cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 3203-3208 (2003).
- Joshi, R. P., Hu, Q., Schoenbach, K. H. Modeling studies of cell response to ultrashort, high-intensity electric fields - Implications for intracellular manipulation. IEEE Trans. Plasma Sci. 32, 1677-1686 (2004).
- Gross, D., Loew, L. M., Webb, W. Optical imaging of cell membrane potential changes induced by applied electric fields. Biophys. J. 50, 339-348 (1986).
- Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. S. pectra membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. Biochemistry. 24, 5749-5755 (1985).
- Loew, L. M. Voltage-sensitive dyes: measurement of membrane potentials induced by DC and AC electric fields. Bioelectromagnetics Suppl. 1, 179-189 (1992).
- Hibino, M., Shigemori, M., Itoh, H., Nagayama, K., Kinosita, K. J. r Membrane conductance of an electroporated cell analyzed by submicrosecond imaging of transmembrane potential. Biophys. J. 59, 209-220 (1991).
- Lojewska, Z., Franks, D. L., Ehrenberg, B., Loew, L. M. Analysis of the effect of medium and membrane conductance on the amplitude and kinetics of membrane potentials induced by externally applied electric fields. Biophys. J. 56, 121-128 (1989).
- Zhang, J., Davidson, R. M., Wei, M. D., Loew, L. M. Membrane electric properties by combined patch clamp and fluorescence ratio imaging in single neurons. Biophys. J. 74, 48-53 (1998).
- Montana, V., Farkas, D. L., Loew, L. M. Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurements of membrane-potential. Biochemistry. 28, 4536-4539 (1989).
- Knisley, S. B., Justice, R. K., Kong, W., Johnson, P. L. Ratiometry of transmembrane voltage-sensitive fluorescent dye emission in hearts. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279, H1421-H1433 (2000).
- Pucihar, G., Miklavčič, D. A time-dependent numerical model of transmembrane voltage inducement and electroporation of irregularly shaped cells. IEEE T. Biomed. Eng. 56, 1491-1501 (2009).
