Directe observatie van Enzymen repliceren DNA met behulp van een Single-molecule DNA Stretching Assay

Summary

We beschrijven een methode voor de waarneming real-time replicatie van individuele DNA-moleculen gemedieerd door eiwitten van de bacteriofaag replicatie systeem.

Abstract

We beschrijven een methode voor de waarneming real-time replicatie van individuele DNA-moleculen gemedieerd door eiwitten van de bacteriofaag replicatie systeem. Gelineariseerd λ DNA is gemodificeerd om een ​​biotine aan het uiteinde van een streng, en een digoxigenine groep aan de andere kant van dezelfde streng zijn. De gebiotinyleerde einde is bevestigd aan een gefunctionaliseerd glazen dekglaasje en het digoxigeninated einde aan een kleine kraal. De montage van deze DNA-kraal aanbinden op het oppervlak van een flow cel kan een laminaire stroming te worden toegepast op een sleepkracht op de korrel uit te oefenen. Als gevolg daarvan is de DNA dicht uitgerekt tot en parallel aan het oppervlak van de dekglaasje op een kracht die wordt bepaald door het debiet (figuur 1). De lengte van het DNA wordt gemeten door het toezicht op de positie van de kraal. Lengte verschillen tussen enkel-en dubbelstrengs DNA worden gebruikt om real-time informatie te verkrijgen over de activiteit van de replicatie eiwitten op de vork. Het meten van de positie van de hiel zorgt voor een precieze bepaling van de tarieven en processivities van DNA rust te komen en polymerisatie (figuur 2).

Protocol

1. DNA-replicatie Template DNA voor de reactie is een gelineariseerde λ DNA gewijzigd door gloeien van oligonucleotiden om een ​​replicatie vork te vormen. Daarnaast is biotine aan het uiteinde van een streng van het DNA λ, en een digoxigenine groep is aan het andere eind van dezelfde streng 1. Materialen: Bacteriofaag λ DNA, Oligonucleotiden: gebiotinyleerd vork arm (A: 5'-biotine-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACA…

Discussion

Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de weerstand kracht uitgeoefend op kralen door laminaire stroming niet enzymatische activiteiten van de replicatie eiwitten beïnvloeden. Bijvoorbeeld, heeft een 3 pN kracht die overeenkomt met een debiet van 0.012 ml / min geen invloed op de replicatie van het DNA toonaangevende streng. Het heeft echter wel invloed op enzymatische activiteiten die plaatsvinden tijdens gecoördineerd DNA-synthese, en daarom moet worden teruggebracht tot 1,5 PN. De wrijving kan eenvoudig worden g…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Bacteriophage λ DNA		New England Biolabs	N3011L
DNA Oligonucleotides		Integrated DNA Technologies
T4 DNA Ligase		New England Biolabs	M0202L
T4 Polynucleotide Kinase		New England Biolabs	M0201L
α-digoxigenin Fab		Roche	11214667001
Tosyl Activated Beads		Dynal/Invitrogen	142-03
Magnetic Separator		Invitrogen	Dynal MPC
3-aminopropyl-triethoxysilane		Sigma	A3648	Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG		Nektar		Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS		Nektar		Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Double-sided tape		Grace BioLabs	SA-S-1L	100 μm thickness
Quartz slide		Technical Glass	20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)	Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing		Becton Dickinson	427416	0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted.
Streptavidin		Sigma	S4762	Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix		New England Biolabs	N0447
Inverted Optical Microscope with 10X Objective		Olympus	Olympus IX-51
Permament rare-earth magnet		National Imports	www.rare-earth-magnets.com
CCD Camera		QImaging	Rolera-XR Fast 139
Syringe Pump		Harvard Apparatus	11 Plus	Operate in refill mode to facilitate solution changes
Fiber Illuminator		Thorlabs Inc.	OSL1