We beschrijven een methode voor de waarneming real-time replicatie van individuele DNA-moleculen gemedieerd door eiwitten van de bacteriofaag replicatie systeem.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Directe observatie van Enzymen repliceren DNA met behulp van een Single-molecule DNA Stretching Assay
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
We beschrijven een methode voor de waarneming real-time replicatie van individuele DNA-moleculen gemedieerd door eiwitten van de bacteriofaag replicatie systeem. Gelineariseerd λ DNA is gemodificeerd om een biotine aan het uiteinde van een streng, en een digoxigenine groep aan de andere kant van dezelfde streng zijn. De gebiotinyleerde einde is bevestigd aan een gefunctionaliseerd glazen dekglaasje en het digoxigeninated einde aan een kleine kraal. De montage van deze DNA-kraal aanbinden op het oppervlak van een flow cel kan een laminaire stroming te worden toegepast op een sleepkracht op de korrel uit te oefenen. Als gevolg daarvan is de DNA dicht uitgerekt tot en parallel aan het oppervlak van de dekglaasje op een kracht die wordt bepaald door het debiet (figuur 1). De lengte van het DNA wordt gemeten door het toezicht op de positie van de kraal. Lengte verschillen tussen enkel-en dubbelstrengs DNA worden gebruikt om real-time informatie te verkrijgen over de activiteit van de replicatie eiwitten op de vork. Het meten van de positie van de hiel zorgt voor een precieze bepaling van de tarieven en processivities van DNA rust te komen en polymerisatie (figuur 2).
Protocol
1. DNA-replicatie Template
DNA voor de reactie is een gelineariseerde λ DNA gewijzigd door gloeien van oligonucleotiden om een replicatie vork te vormen. Daarnaast is biotine aan het uiteinde van een streng van het DNA λ, en een digoxigenine groep is aan het andere eind van dezelfde streng 1.
Materialen: Bacteriofaag λ DNA, Oligonucleotiden: gebiotinyleerd vork arm (A: 5'-biotine-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGTCCAACTTGCTGTCC-3 '), λ-complementaire vork arm (B: 5'-GGGCGGCGACCTGGACAGCAAGTTG GACAATCTCGTTCTATCACTAATTCACTAATGCAGGGAGGATTTCAGATATGGCA-3'), v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de weerstand kracht uitgeoefend op kralen door laminaire stroming niet enzymatische activiteiten van de replicatie eiwitten beïnvloeden. Bijvoorbeeld, heeft een 3 pN kracht die overeenkomt met een debiet van 0.012 ml / min geen invloed op de replicatie van het DNA toonaangevende streng. Het heeft echter wel invloed op enzymatische activiteiten die plaatsvinden tijdens gecoördineerd DNA-synthese, en daarom moet worden teruggebracht tot 1,5 PN. De wrijving kan eenvoudig worden gec.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
De ontwikkeling van de DNA-stretching test werd geholpen door Paul Blainey, Jong-Bong Lee, en Samir Hamdan. Dit werk wordt ondersteund door de National Institutes of Health beurzen aan Charles Richardson (GM54397) en Antoine van Oijen (GM077248).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bacteriofage λ DNA | New England Biolabs | N3011L | |
| DNA-oligonucleotiden | Integrated DNA Technologies | ||
| T4 DNA-ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T4 polynucleotidekinase | New England Biolabs | M0201L | |
| α-digoxigenine Fab | Roche Group | 11214667001 | |
| Tosyl-geactiveerde beads | Invitrogen | 142-03 | |
| Magnetische separator | Invitrogen | Dynal MPC | |
| 3-aminopropyl-triethoxysilaan | Sigma-Aldrich | A3648 | Andere aminosilaanen kunnen worden gebruikt of gemengd met niet-amine-reactieve silaanen voor minder dichte oppervlakken |
| Succinimidylpropionaat PEG | Nektar | Vergelijkbare PEG's kunnen worden gekocht bij Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | |
| Biotine-PEG-NHS | Nektar | Vergelijkbare PEG's kunnen worden gekocht bij Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | |
| Dubbelzijdige tape | Grace Bio-Lab Inc. | SA-S-1L | 100 μm dikte |
| Kwartsglasplaatje | Technical Glass | 20 mm (B)x 50 mm (L)x 1mm (H) | Afmeting passend op dekglasjes. Gaten boren met diamantboortjes (DiamondBurs.net) |
| Polyethyleen buisjes | BD Biosciences | 427416 | 0,76 mm ID, 1,22 OD Andere buisjesmaten kunnen worden gebruikt. |
| Streptavidine | Sigma-Aldrich | S4762 | Maak 1 mg/mL oplossing, 25 μL aliquoten in PBS pH 7,3 |
| Deoxyribonucleotide-trifosfaat mengsel | New England Biolabs | N0447 | |
| Inverteerde optische microscoop met 10X objectief | Olympus Corporation | Olympus IX-51 | |
| Permanente neodymiummagneet | National Imports | www.rare-earth-magnets.com | |
| CCD-camera | QImaging | Rolera-XR Fast 139 | |
| Spuitpomp | Harvard Apparatus | 11 Plus | Bedien in navulmodus om oplossingswisselingen te vergemakkelijken |
| Glasvezel-illuminator | Thorlabs Inc. | OSL1 |
Referenties
- Lee, J. B. DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication. Nature. 439, 621-624 (2006).
- Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merril....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
