Summary

Directe observatie van Enzymen repliceren DNA met behulp van een Single-molecule DNA Stretching Assay

Published: March 23, 2010
doi:

Summary

We beschrijven een methode voor de waarneming real-time replicatie van individuele DNA-moleculen gemedieerd door eiwitten van de bacteriofaag replicatie systeem.

Abstract

We beschrijven een methode voor de waarneming real-time replicatie van individuele DNA-moleculen gemedieerd door eiwitten van de bacteriofaag replicatie systeem. Gelineariseerd λ DNA is gemodificeerd om een ​​biotine aan het uiteinde van een streng, en een digoxigenine groep aan de andere kant van dezelfde streng zijn. De gebiotinyleerde einde is bevestigd aan een gefunctionaliseerd glazen dekglaasje en het digoxigeninated einde aan een kleine kraal. De montage van deze DNA-kraal aanbinden op het oppervlak van een flow cel kan een laminaire stroming te worden toegepast op een sleepkracht op de korrel uit te oefenen. Als gevolg daarvan is de DNA dicht uitgerekt tot en parallel aan het oppervlak van de dekglaasje op een kracht die wordt bepaald door het debiet (figuur 1). De lengte van het DNA wordt gemeten door het toezicht op de positie van de kraal. Lengte verschillen tussen enkel-en dubbelstrengs DNA worden gebruikt om real-time informatie te verkrijgen over de activiteit van de replicatie eiwitten op de vork. Het meten van de positie van de hiel zorgt voor een precieze bepaling van de tarieven en processivities van DNA rust te komen en polymerisatie (figuur 2).

Protocol

1. DNA-replicatie Template DNA voor de reactie is een gelineariseerde λ DNA gewijzigd door gloeien van oligonucleotiden om een ​​replicatie vork te vormen. Daarnaast is biotine aan het uiteinde van een streng van het DNA λ, en een digoxigenine groep is aan het andere eind van dezelfde streng 1. Materialen: Bacteriofaag λ DNA, Oligonucleotiden: gebiotinyleerd vork arm (A: 5'-biotine-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACA…

Discussion

Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de weerstand kracht uitgeoefend op kralen door laminaire stroming niet enzymatische activiteiten van de replicatie eiwitten beïnvloeden. Bijvoorbeeld, heeft een 3 pN kracht die overeenkomt met een debiet van 0.012 ml / min geen invloed op de replicatie van het DNA toonaangevende streng. Het heeft echter wel invloed op enzymatische activiteiten die plaatsvinden tijdens gecoördineerd DNA-synthese, en daarom moet worden teruggebracht tot 1,5 PN. De wrijving kan eenvoudig worden g…

Acknowledgements

De ontwikkeling van de DNA-stretching test werd geholpen door Paul Blainey, Jong-Bong Lee, en Samir Hamdan. Dit werk wordt ondersteund door de National Institutes of Health beurzen aan Charles Richardson (GM54397) en Antoine van Oijen (GM077248).

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Bacteriophage λ DNA   New England Biolabs N3011L  
DNA Oligonucleotides   Integrated DNA Technologies    
T4 DNA Ligase   New England Biolabs M0202L  
T4 Polynucleotide Kinase   New England Biolabs M0201L  
α-digoxigenin Fab   Roche 11214667001  
Tosyl Activated Beads   Dynal/Invitrogen 142-03  
Magnetic Separator   Invitrogen Dynal MPC  
3-aminopropyl-triethoxysilane   Sigma A3648 Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG   Nektar   Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS   Nektar   Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Double-sided tape   Grace BioLabs SA-S-1L 100 μm thickness
Quartz slide   Technical Glass 20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H) Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing   Becton Dickinson 427416 0.76 mm ID, 1.22 OD
Other size tubing can be substituted.
Streptavidin   Sigma S4762 Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix   New England Biolabs N0447  
Inverted Optical Microscope with 10X Objective   Olympus Olympus IX-51  
Permament rare-earth magnet   National Imports www.rare-earth-magnets.com  
CCD Camera   QImaging Rolera-XR Fast 139  
Syringe Pump   Harvard Apparatus 11 Plus Operate in refill mode to facilitate solution changes
Fiber Illuminator   Thorlabs Inc. OSL1  

References

  1. Lee, J. B. DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication. Nature. 439, 621-624 (2006).
  2. Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).
  3. Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption. Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).
  4. Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. J Vis Exp. , (2009).
  5. Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457, 336-339 (2009).
  6. van Oijen, A. M. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).

Play Video

Cite This Article
Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J. Vis. Exp. (37), e1689, doi:10.3791/1689 (2010).

View Video