Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Veel studies adres celmigratie met behulp van
Protocol
Voorbereiding
- Verkrijgen van juiste Drosophila regels met een hemocyte-specifieke Gal4 driver (bv SRP-Gal4 2) en een genetisch gecodeerd fluorescerende reporter onder controle UAS (bijv. UAS-GFP). Vliegen homozygoot zijn voor SRP-Gal4, UAS-GMA 3 of CRQ-Gal4, UAS-GFP 4, 5 zijn vooral nuttig voor imaging doeleinden (nb GMA is GFP gefuseerd aan het actine-bindende domein van Moesin), zie hieronder voor een bespreking van het bereik van de Gal4 drivers en UAS construeert beschikbaar (de Bloomington Stock Centre bevat een breed scala).
- Typisch genetische kruizen zijn zodanig uitgevoerd dat mutante allelen in evenwicht zijn met behulp van fluorescerende balancers CTG of TTG 6, met Gal4 chauffeurs en UAS bouwt uitgevoerd op alternatieve homologe chromosomen. Dit maakt het mogelijk om te selecteren homozygote mutanten op basis van de afwezigheid van CTG / TTG-geassocieerde GFP fluorescentie (dit gebeurt in fase 2.11).
- Amplify voorraden en plaats vliegen in een kooi leggen met een appelsap agarplaat 7. De vliegen moeten ten minste twee dagen om te acclimatiseren aan de kooi leggen voordat genoeg embryo's beginnen te worden gelegd. In het algemeen twintig vliegen van elk geslacht zou voldoende moeten zijn om genoeg embryo's voor de beeldvorming te genereren, maar dient te worden opgemerkt dat de verschillende lijnen hebben verschillende graden van vruchtbaarheid. We maken gebruik van 55mm Petri gerechten die passen in de onderkant van een plastic beker, doorboord op de voet, waardoor luchtstroom mogelijk te maken. De exacte wijze van het embryo is onbelangrijk, maar de tijden zijn van cruciaal belang om volledig te kunnen verzamelen geënsceneerd embryo's.
- Verzamel embryo's van een 's nachts appelsap agarplaat gehandhaafd op 25 ° C of vanaf een getimede plaat. Voor deze laatste hebben we meestal laten de vliegen om op een voorverwarmd bord leggen voor 4 uur, voor het verwijderen van de plaat en het plaatsen van het op 18 ° C voor 15 tot 16 uur voorafgaand aan de montage van embryo's, dit biedt embryo's vanaf de late stadium 12 tot en met 15 van ontwikkelingsfase. Een overnachting plaat bevat een grotere diversiteit van fasen, maar biedt het voordeel van hogere niveaus van fluorescerende reporter uitdrukking in hemocytes als gevolg van een langere periode bij 25 ° C als de Gal4-UAS-systeem is de temperatuur gevoelig.
Procedure
- Verjagen embryo's uit de appelsap agarplaat met behulp van een kleine hoeveelheid water en een zachte punt penseel. Verdreven embryo's kunnen gemakkelijk worden gezien met het blote oog.
- Transfer embryo's aan een cel zeef (Fisher) of zelfgemaakte mand 7 door het gieten van water uit de appelsap agarplaat in de mand hield meer dan een beker om afvalwater te verzamelen.
- Herhaal stap 2.2 tot je tevreden bent u over voldoende embryo's overgebracht van de appelsap agarplaat.
- Was de embryo's in cel zeef / mand met water.
- Plaats cel zeef / mandje in de petrischaal deksel van de appelsap agarplaat en voeg genoeg nette bleekmiddel om embryo's te schorten in de cel zeef / mand.
- Volg dechorionation van de embryo's op een dissectie microscoop onder helderveld: dechorionation is voltooid wanneer de dorsale aanhangsels zijn opgelost, die moet plaatsvinden binnen twee minuten.
- Verwijder de cel zeef / mand met embryo's uit het bleekmiddel en afwassen resterende bleekmiddel met water. Alle sporen van bleekmiddel moet worden verwijderd alvorens tot 2,8 stap. Een truc om te beoordelen of al het bleekmiddel is verwijderd is te wissen uit restwater op blauw-gekleurde laboratorium weefsels - als er sprake is resterende bleek de blauwe kleur wordt gebleekt wit / roze.
- Blot de overgebleven water met behulp van laboratorium-tissue / mediwipes aangebracht op de onderzijde van de cel zeef / mand.
- Plaats een druppel water in een petrischaal deksel. Met een fijne penseel, het verzamelen van alle dechorionated embryo's uit het embryo mand en resuspendeer ze in de druppel. Naast droog de embryo's door aspireren water met behulp van een micropipet of zorgvuldig absorberen met een laboratorium tissue / mediwipes.
- Zodra de embryo's zijn gedroogd, voeg een druppel olie voltalef om alle embryo's te dekken. Leg een tweede kleine druppel olie naast de druppel die de embryo's. NB we zijn niet in staat om een Britse leverancier van voltalef olie te vinden, halogene olie 700 (Sigma) kan worden gebruikt.
- Onder een tl-dissectie microscoop kies de juiste geënsceneerd embryo's van het gewenste genotype behulp van een paar horlogemakers pincet (nummer 5) van de olie-druppel. Deze tang moet worden naar binnen gebogen (figuur 1) om scheppen van de embryo's zonder aanprikken van hun vitelline membraan. Overdracht geselecteerde embryo's naar de tweede olie-druppel. Het is belangrijk dat u in staat bent om fluorescerende hemocytes zien op het ontleden microscoop om te kunnen goede beelden te verzamelen over de confocale microscoop (figuur 2). We meestal monteren stadium 13/14 embryo's om de afbeelding laterale migratie van hemocytes op het ventrale middellijn of het stadium 15 embryo'shet imago van de beweeglijkheid van hemocytes volgende spreiding over het embryo.
- Stick twee dekglaasjes (18x18mm, dikte 1) aan de onderzijde van een Petriperm / Lumox schaal (Sarstedt), met behulp van twee kleine druppels voltalef olie, laat ongeveer 1 cm tussen hen (figuur 3), deze zal worden gebruikt om een dekglaasje geplaatst over ondersteuning de embryo's, zodat ze niet te verpletteren. Petriperm gerechten (50mm diameter) bevatten een hydrofoob, gas-permeabel membraan. We vinden dat de gerechten worden eenvoudiger te gebruiken nadat ze zijn meerdere keren gebruikt (gerechten kunnen worden afgenomen met 70% ethanol en hergebruikt).
- Onder helderveld op de dissectie microscoop, pick-up geselecteerde embryo's een voor een met de gebogen pincet en lijn ze ventrale zijde naar boven en evenwijdig aan de rand van de dekglaasjes (figuur 3). Het is mogelijk om maximaal af te stemmen op 15 embryo's op deze manier, afhankelijk van je handigheid en uw geduld. Het is belangrijk om voorzichtig te manipuleren de embryo's als zowel de embryo's en Petriperm schotel membraan zijn kwetsbaar en kan gemakkelijk worden verbroken.
- Zodra de embryo's zijn uitgelijnd voeg een klein druppeltje olie en laat het verspreiden naar een homogene laag tussen de twee dekglaasjes formulier. Nadat de olie zich heeft verspreid (dit kan enkele minuten duren), controleren of de embryo's nog ventrale zijde naar boven. Als de embryo's zijn licht gerold, opnieuw verplaatsen ze met de tang.
- Ten slotte is met behulp van een pincet (nummer 3) plaats een dekglaasje (18x18mm, dikte 1) over de embryo's, rust op de twee eerder aangehouden dekglaasjes. Lijm dit dekglaasje aan het dekglaasje ondersteunt het gebruik van nagellak (figuur 3).
- Neem de Petriperm schotel met gemonteerde's naar de confocale of wide-field microscoop en monteer het Petriperm schotel op het podium met een geschikte adapter. Ofwel een rechtopstaande of omgekeerde microscoop kan worden gebruikt, met als doel lens scherpstellen door de dekglaasje (in tegenstelling tot door het membraan).
Vertegenwoordiger Resultaat:
Dit protocol wordt beschreven hoe u Drosophila embryo's monteren voor live beeldvorming van hemocytes aan de ventrale zijde van het embryo. Als dit juist gebeurt zal het eenvoudig om zowel foto's of films van hemocytes te genereren. De belangrijkste determinant is de microscoop gebruikt om het imago van de hemocytes (in het bijzonder het objectief), maar de aard van de verworven de beelden zal ook afhangen van het stadium van ontwikkeling, de temperatuur van de embryo's zijn gerezen bij de Gal4 en UAS-lijnen gebruikt.
Hogere niveaus van fluorescerend proteïne-expressie in staat zal stellen hemocytes af te beelden met meer gemak, daarom is het belangrijk om te kunnen hemocytes zien wanneer de embryo's in stadium 2.11 van het protocol (Figuur 2 bevat voorbeelden van duidelijke hemocytes binnen de embryo's, genomen met een camera gemonteerd op een dissectie microscoop). Daarom verhoogde aantallen Gal4 en UAS construeert in staat stellen een grotere signaal-ruisverhouding. Bovendien is deze vermindert de noodzaak voor een hoge intensiteit laser of een verhoogde blootstelling momenten waarop beeldvorming, die op hun beurt in staat stelt hemocyte gedrag te worden gevolgd voor langere tijd.
Zeer hoge niveaus van GFP expressie komen opdagen fijne details van hemocyte morfologie, met name de dunne plaat-achtige lamellen dat de circulaire cellichaam (Figuur 4A-B) surround. Circulaire regio's met uitzondering van GFP vertegenwoordigen fagosomen (Figuur 4A-C). Vinger-achtige filopodia kan ook worden gezien die uit de lamellen (Figuur 4B). Twee Gal4 drivers nog voldoende zijn om deze processen (Figuur 4C), zie in het bijzonder indien een of meer is SRP-Gal4 (zie bespreking), maar langzamer scansnelheden of hoger laser vermogen op de confocale microscoop kan nodig zijn. Aangezien een daling expressie niveaus wordt het steeds moeilijker om het imago van de uitsteeksels van hemocytes, toch is het nog steeds mogelijk om de migratie van hemocytes baan onder deze voorwaarden als het cellichaam blijft voor de hand liggende, zelfs als uitsteeksels zijn minder duidelijk (Figuur 4D).
In eerdere stadia van ontwikkeling (tot 13 stadium) hemocytes migreren in nauw contact met elkaar en is het vaak moeilijk te onderscheiden individuele cellen. Tegen het einde van fase 13 hemocytes een enkele lijn in het ventrale middellijn (figuur 5A) gevormd, daarna, steeds beweeglijk, lateraal migreren naar de randen van de ventrale zenuw snoer (Figuur 5B). Het actine cytoskelet in de dynamische uitsteeksels van hemocytes kan direct worden waargenomen door de expressie van de GMA (figuur 5C) of cherry-Moesin.
Montage van de embryo's op deze manier kunnen de gasuitwisseling en voorkomt uitdroging en embryo's blijven levensvatbaar na beeldvorming. Als het embryo is beschadigd tijdens de montage is het meestal vanzelfsprekend als het embryo inhoud gaan lekken door middel van haar vitelline membraan. Als een embryo niet begint te drogen dan kan dit vaak gezien door vervormingen in de vitelline membraan. Af en toe een embryo zal rollen in de loop van een timelapse film, maar dit heeft de neiging alleen problematisch voor de langere termijn films. Lastly, montage meerdere embryo's in een keer geeft de experimentator de beste kans voor het verkrijgen van een embryo in de perfecte oriëntatie voor hun experiment.
Figuur 1. Pincet voor manipulatie van dechorionated embryo's.
De uiteinden van horlogemakers pincet (formaat nummer 5) moet worden gebogen om de mode een hulpmiddel om scheppen embryo's zoals hier te zien. De buitenkant van de gebogen regio is ook nuttig om embryo's te manipuleren bij het plaatsen op de Petriperm membraan als zij bezitten geen scherpe randen die zouden kunnen doorboren van de embryo.
Figuur 2. Representatief beeld van de embryo's dat zal opleveren goede live imaging resultaten.
Beelden van dechorionated embryo's in voltalef olie (in fase 2.11 van het protocol) genomen op een fluorescerende dissectiemicroscoop. Zijdelings uitzicht op het podium 13 (A) en fase 15 (B) SRP-Gal4, UAS-GFP, CRQ-Gal4, UAS-GFP embryo's. Zijaanzicht van een etappe 15 SRP-Gal4, UAS-GFP / +; CRQ-Gal4, uas-GFP/uas-N17Rac embryo (C) waarin hemocytes er niet in geslaagd om uit te migreren van het hoofd, waaruit blijkt hoe embryo's eruit zien als hemocytes zijn niet duidelijk langs hun migratieroutes. Zijaanzicht van een podium 17 SRP-Gal4, UAS-GFP, CRQ-Gal4, UAS-GFP embryo met de ingewikkelde structuur van de darm in dit stadium van ontwikkeling (D), het begin van de spieren voorkomt leven in beeld brengen van embryo's buiten dit stadium van ontwikkeling. Ventrale uitzicht van fase 13 (E) en fase 14 (F) SRP-Gal4, UAS-rood stinger embryo's laten zien verspreiding van hemocytes met fluorescent gelabelde kernen. Observatie van hemocytes met behulp van fluorescentie in fase 2.11 van het protocol is een eerste vereiste om uitstekende beelden te verkrijgen, anterior is aan de rechterkant voor alle beelden.
Figuur 3. Montage van embryo's op een Petriperm / Lumox gerecht.
Twee 18x18mm dekglaasjes (dikte 1) zitten vast aan de bodem gezicht van de Petriperm schotel met een kleine druppel olie, gescheiden door ongeveer 1 cm, zoals afgebeeld. Embryo's worden dan opgesteld ventrale zijde naar boven met hun lange (anterior-posterior) as parallel aan de randen van de dekglaasjes en bedekt met een druppeltje olie. Zodra de olie zich heeft verspreid om de kloof tussen de twee dekglaasjes derde dekglaasje (18x18mm dikte 1) voorzichtig wordt geplaatst op de top van de met olie besmeurde embryo's met behulp van de twee eerder aangehouden dekglaasjes als een brug naar de embryo's te voorkomen dat geplet te vullen. Dit dekglaasje wordt daarna met lijm aan de twee bruggen dekglaasje met behulp van twee kleine druppeltjes nagellak. Eenmaal ingesteld, kan de embryo's worden afgebeeld op een rechte of omgekeerde microscoop met de objectief lens scherpstellen beneden door de dekglaasje (in plaats van via de Petriperm membraan).
Figuur 4. Representatieve resultaten van live beeldvorming van GFP gelabelde hemocytes.
Z-projecties van hemocytes aan de ventrale zijde van een stage 14 SRP-Gal4, UAS-GFP, CRQ-Gal4, UAS-GFP embryo (AB). (A) is een kleinere vergroting beeld, zoals gebruikt voor de ontwikkeling hemocyte migraties in timelapse films te controleren. (B) is een sterkere vergroting nog van hemocytes aan de ventrale middellijn, met fijne details van hun morfologie. (C) is een 1 m sneetje hemocytes op de ventrale middellijn in een stadium 14 SRP-Gal4, UAS-GFP / +; CRQ-Gal4, UAS-GFP / + embryo, waaruit blijkt dat lagere aantal kopieën van het Gal4 chauffeurs en UAS constructen zijn ook voldoende om goede beelden te genereren. (D) geeft een z-projectie van hemocytes in een stadium 14 CRQ-Gal4, UAS-GFP embryo. Hier hemocyte uitsteeksels zijn minder voor de hand als gevolg van lagere expressie van GFP, maar het is nog steeds mogelijk om films te maken en hemocyte migratie track met deze combinatie van Gal4 chauffeur en UAS bouwen. Beelden werden genomen op een Leica LSM510 confocale microscoop, voorste is in alle beelden; de ringen aan de rand van de beelden worden veroorzaakt door vitelline membraan autofluorescentie.
Figuur 5. Representatieve resultaten van live beeldvorming van GMA uiten hemocytes.
Z-projecties van hemocytes aan de ventrale middellijn van fase 13 (A) en fase 14 (B) SRP-Gal4, UAS-GMA embryo's, afkomstig uit timelapse films tot ontwikkeling migraties van hemocytes te tonen. Gedetailleerde informatie over actine dynamiek kan worden verkregen door een hogere vergroting beeldvorming van GMA uiten hemocytes (C). GMA bestaat uit GFP gefuseerd aan het actine-bindende domein van Moesin en labels actine filamenten. Anterior is in alle beelden; foto's zijn genomen op een confocale microscoop.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De belangrijkste elementen van deze procedure zijn de selectie van gezonde embryo's met duidelijk gelabeld hemocytes en zorgvuldig te monteren ze zonder ze te beschadigen. Zodra de embryo's worden in de halogene olie zijn ze bestand tegen uitdroging en eenmaal gemonteerd kunnen worden afgebeeld voor enkele uren. In onze handen kunnen wij image hemocytes drie uur lang, met een verwaarloosbare uitdroging van het embryo of de voor de hand liggende foto-schade, het nemen van een z-stack van beelden om de drie minute...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dankbetuigingen
Dit protocol is ontwikkeld door middel van ons werk binnen en in samenwerking met de laboratoria van Paul Martin en Antonio Jacinto. Wij danken de Bloomington Stock Centrum voor zijn uitstekende service en de Drosophila gemeenschap voor de voortzetting van te vliegen lijnen te delen. BS wordt momenteel gefinancierd door een BBSRC projectsubsidie. WW wordt gefinancierd door een Wellcome Trust Career Development Fellowship.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cellzeef | BD Biosciences | 352350 | 70μm poriën |
| Halcarbon-olie 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Lumox/Petriperm schaal | Sarstedt Ltd | 96077305 |
Referenties
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bruckner, K. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7, 73-84 (2004).
- Dutta, D., Bloor, J. W., Ruiz-Gomez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D. P. Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin. Genesis. 34, 146-151 (2002).
- Stramer, B. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).
- Halfon, M. S. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34, 135-138 (2002).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2000).
- Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila. Development. 120, 1829-1837 (1994).
- Millard, T. H., Martin, P. Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure. Development. 135, 621-626 (2008).
- Doerflinger, H., Benton, R., Shulman, J. M., St Johnston, D. The role of PAR-1 in regulating the polarised microtubule cytoskeleton in the Drosophila follicular epithelium. Development. 130, 3965-3975 (2003).
- Olofsson, B., Page, D. T. Condensation of the central nervous system in embryonic Drosophila is inhibited by blocking hemocyte migration or neural activity. Dev Biol. 279, 233-243 (2005).
- Paladi, M., Tepass, U. Function of Rho GTPases in embryonic blood cell migration in Drosophila. J Cell Sci. 117, 6313-6326 (2004).
- Vlisidou, I. Drosophila embryos as model systems for monitoring bacterial infection in real time. PLoS Pathog. 5, e1000518-e1000518 (2009).
- Jacinto, A. Dynamic actin-based epithelial adhesion and cell matching during Drosophila dorsal closure. Curr Biol. 10, 1420-1426 (2000).
- Wood, W., Jacinto, A. Imaging cell movement during dorsal closure in Drosophila embryos. Methods Mol Biol. 294, 203-210 (2005).
- Kunwar, P. S. Tre1 GPCR initiates germ cell transepithelial migration by regulating Drosophila melanogaster E-cadherin. J Cell Biol. 183, 157-168 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
