השרשה של Ferumoxides תווית אדם בתאי גזע mesenchymal ב פגמים סחוס

Summary

המטרה של המצגת היא להדגים שיטה לשחזור מאוד ליצור מטריצה ​​תא הקשורים שתלים גזע פגמים הסחוס, אשר יכול להיות דמיינו עם MR הדמיה. בתאי גזע מסומנים עם ה-FDA Ferumoxides, מעורבב עם agarose, מושתלים לתוך פגמים סחוס צילמו עם סורק 7T MR.

Abstract

תחום הנדסת הרקמות משלבת את עקרונות הביולוגיה, ההנדסה והרפואה תא לקראת התחדשות של תאים ספציפיים רקמות תפקודית. מטריקס תאים הקשורים גזע שתלים (מאסי) במטרה לחדש פגמים הסחוס עקב פציעות משותף דלקת פרקים או טראומטי. למבוגרים בתאי גזע mesenchymal (MSCs) יש את היכולת להתמיין לתאי השושלת chondrogenic ו הראו תוצאות מבטיחות עבור התא מבוססי טכנולוגיות הסחוס במפרק לתקן. עצמיים MSCs יכול להיות מבודד במגוון של רקמות, ניתן להרחיב בתרביות תאים מבלי לאבד פוטנציאל הבידול שלהם, הדגימו בידול chondrogenic במבחנה ^{1 vivo, 2.}

כדי לספק שמירה מקומיים הכדאיות של MSCs המושתלים פגמים סחוס, פיגום יש צורך, התומך גם בידול התפשטות עתידיים. הארכיטקטורה של היווצרות רקמה פיגום מדריכים מאפשר תאי מטריקס, המיוצר על ידי בתאי גזע, להרחיב. תחקירים קודמים הראו כי 2% agarose פיגום עשוי לתמוך בפיתוח של הסחוס hyaline יציב ואינו לגרום התגובה החיסונית ^3.

שימור ארוך טווח של בתאי גזע מושתלים מאסי הוא קריטי עבור התחדשות הסחוס. תיוג של MSCs תחמוצת ברזל עם חלקיקים מאפשר לטווח ארוך מעקב vivo עם פולשנית טכניקות הדמיה MR ^4.

מצגת זו תדגים טכניקות MSCs תיוג עם חלקיקי תחמוצת ברזל, הדור של תאים agarose בונה ההשתלה של מבנים אלה לתוך פגמים הסחוס. בונה שכותרתה ניתן לעקוב הלא פולשני עם MR-Imaging.

Protocol

1. תיוג של hMSCs עם Endorem

1. התאים גדלים על מפגש 80% לפחות 18 שעות לפני תיוג.
2. במהלך תקופה זו, התקשורת תיוג מוכן ידי הוספת Endorem המדגם במינון של 100 UG Fe / מ"ל ​​סרום ללא התקשורת.
3. אחרי התאים גדלים על מפגש, תרבות מדיה aspirated תאים נשטפים 1x עם PBS או סרום ללא התקשורת.
4. בשלב הבא, הפתרון הוא לשטוף aspirated והתקשורת תיוג מוכן בעבר הוא הוסיף. התאים מודגרת אז 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 4 שעות.
5. לאחר דגירה 4 שעות, תיוג מדיה aspirated ותאי הם שטופים עם PBS ו trypsinized כרגיל.
6. Trypsinized פעם, תאים נשטפים 3x עם PBS ו centrifuged ב 400rcf במשך 5 דקות.
7. לאחר שלב זה כביסה, תאים resuspended, נספר, העריכו את הכדאיות, ושימש הדרושים לניסויים.

2. הכנת agarose

1. אחרי התאים סומנו בתווית זה הזמן להכין את הפתרון agarose.
2. בסולם בסדר, 80mg של agarose אבקת הם שקלו להוסיף 2ml של PBS.
3. פתרון זה אז מזועזע בעדינות autoclaved.
4. לאחר כ 40 דקות, הפתרון נוזל agarose ניתן לקחת מתוך החיטוי. היקף צריכה להיות מדודה מותאמים בהתאם עם PBS שחומם מראש.
5. אז הפתרון הוא מקורר עד 42 ° C

3. יצירת מאסי

1. כאשר הפתרון agarose הגיעה הטמפרטורה הרצויה, התאים נספרים ו centrifuged בפעם האחרונה בצינור 1.5ml Eppendorf.
2. לאחר צנטריפוגה, supernatant הוא מושלך לבין התאים מעורבבים עם DMEM להגיע ריכוז של 30 x 10 ⁶ תאים / מ"ל.
3. עכשיו התאים מעורבבים עם 42 ° C agarose חם.
4. טיפ פיפטה קר עלול לגרום agarose לגבש בתוך קצה, ולכן מומלץ קצה מחממים ידי pipetting חם סטרילי PBS למעלה ולמטה
5. עכשיו, באותו נפח של agarose כמו התקשורת נלקח למעלה מעורב באופן יסודי עם ההשעיה התא מדיה כך השעיה אחיד נוצרת.
6. שמור את הצינור Eppendorf בתוך אמבט מים שחומם מראש תוך ערבוב כך agarose אינו להתקרר מספיק כדי לחזק.
7. כאשר ההשעיה היא הומוגנית, התאים המושתלים הפגם.

באיור 1. העטרה תמונות T2 משוקלל SE (TR 4000 ms / TE 18.27 ms) של דגימה פיקת הברך עם hMSCs מושתל פגמים הסחוס.

Discussion

פרוטוקול תיאר מספק דרך לשחזור לתייג MSCs חלקיקי תחמוצת ברזל עם השתל ואת אלה MSCs שכותרתו לתוך פגמים הסחוס. טכניקה זו מאפשרת לא פולשנית תיאור של השתלת תא גזע פגמים סחוס עם MR הדמיה, המאפשרת גילוי מוקדם של כשל מאסי. נקע או בזרימת של תאים שכותרתו ניתן לאבחן מבוסס על היעלמותה של התווית מהאתר השתלת על תמונות MR. אבחון מוקדם של אירועים אלו רצוי היה למנוע את החולה חלופה הליכים מיותרים אבחון פולשניות. תיאר שיטה לא פולשנית לאבחון תוצאות מאסי, יכול לסייע בפיתוח מוצלח של טיפולים מבוססי תאים להתחדשות הסחוס דלקת מפרקים ניוונית. פרוטוקול שלנו המוחל כעת במחקרים פרה ב-vivo, יהיה עקרונית החלים קלינית יכולה לשמש כמדד לא פולשנית התוצאה להערכת טיפולים מאסי בפרקטיקה הקלינית.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
D-MEM High Glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	D5648
PBS (Ca++, Mg++ free)		GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Trypsin-EDTA 0.05%		Invitrogen	25399-120
FBS		Hyclone	SH30071.03
Penicillin/Streptomycin		GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Ferumoxides (Endorem)		Guerbet
Agarose Typ VII		Sigma-Aldrich	A9045	Dilute Agarose in PBS to final concentration of 4%