Summary
Dieses Protokoll zeigt Methoden zur Gewinnung von Spermien aus den Hoden der Männchen und dann Besamung weiblichen Mäusen. Dieses Verfahren ist nützlich, wenn die genaue Zeit in entwicklungspsychologischen Studien sowie transgene Arbeit benötigt wird.
Abstract
Nagetiere der Gattung Peromyscus (Reh-Mäuse) sind die am weitesten verbreitete Muttersprache in Nordamerika Säugetiere. Peromyscus Arten sind in einem breiten Spektrum von Forschungsgebieten einschließlich Toxikologie, Epidemiologie, Ökologie, Verhaltens-und genetischen Studien verwendet. Hier sind sie ein nützliches Modell für die Demonstrationen der künstlichen Besamung.
Methoden ähnlich denen hier angezeigten zuvor in mehrere Hirsche Maus-Studien verwendet wurde, noch keine detaillierten Protokoll veröffentlicht worden. Hier zeigen wir die grundlegende Methode der künstlichen Befruchtung. Dieses Verfahren beinhaltet das Extrahieren der Hoden aus dem Nagetier, dann Isolierung der Spermien aus dem Nebenhoden und Samenleiter. Die reifen Spermien, jetzt in einem Milch-Gemisch, werden in den weiblichen Genitaltrakt auf die Zeit des Eisprungs platziert. Die Befruchtung wird als Tag 0 für Timing der Entwicklung des Embryos gezählt. Embryonen können dann zur gewünschten Zeit-Punkt abgerufen und manipuliert werden.
Künstliche Befruchtung kann in einer Vielzahl von Nagetieren, wo genau Embryo Timing ist entscheidend, oder schwer zu bekommen verwendet werden. Diese Technik ist von entscheidender Bedeutung für Arten oder Stämme (darunter die meisten Peromyscus), die sich nicht paaren können sofort und / oder wo Paarung ist schwer zu beurteilen. Darüber hinaus bietet die künstliche Besamung genaue Zeitpunkt für die Entwicklung des Embryos entweder in Abbildung Entwicklungsfortschritte und / oder transgene Arbeit. Reduzierte Anzahl von Tieren verwendet werden, da die Befruchtung gewährleistet ist. Diese Methode wurde entscheidend für die Förderung der Peromyscus System, und wird hoffentlich profitieren auch andere.
Protocol
Künstliche Befruchtung
Künstliche Befruchtung wird anstelle der natürlichen Paarung, um die Chancen, dass alle Frauen geworden sind wird schwanger zu erhöhen. 2 männliche wurde für alle 1 superovulierten Weibchen oder ein Weibchen bekannt, in Östrus verwendet werden. Die caudae Nebenhoden von reifen männlichen Mäusen wurden in einer 9% Milch Suspension gegeben und offen mit 18-Gauge-Nadel in Scheiben geschnitten. Das Sperma wurde erlaubt, sich frei zu schwimmen ein paar Minuten und dann den Nebenhoden wurden aus dem Gemisch entnommen. Die Suspension wurde mit einem Mikroskop für Zusammenfluss und beweglichen Spermien untersucht. Eine stumpfe 22 Gauge 1 ½ Zoll lange Nadel verwendet wurde, um die Spermien zu verwalten. A 120 °-Bogen war etwa 3 / 4 th dem Weg nach unten die Nadel gesetzt. 0.05mls injiziert - Die Nadel wurde in die Vagina bis zur Kurve und 0,025 eingesetzt. Wenn ein Assistent wird verwendet, um das Weibchen in die entsprechende Position zu halten, ist der Einsatz von Anästhetika nicht benötigt.
Vorbereitung
- Verwenden Sie 4 Rüden für 6 Frauen
- Euthanize Männchen das Vivarium
- Bereiten Sie ca. 5 ml 9% Milch aus Milchpulver
- Legen Sie 1,5 ml in kleine Petrischale
- Schneiden Sie die Nebenhoden und Samenleiter
- Legen Sie in 1.5ml von 9% Milch
- Mit zwei 18-Gauge-Nadel und mit langen Schneiden Bewegung mit Nadeln, aufschneiden der Nebenhoden und Samenleiter die Spermien Release
- Nehmen Sie links über Gewebe und prüfen Spermien unter dem Mikroskop
Injektion
- Verwenden Sie stumpfen Nadel bei 120 ° Winkel
- Halten Sie die Maus in der Hand und spritzen Mischung. Bei Unwohlsein mit einer Person, und die Injektion können zwei Personen genutzt werden. Keine Narkose sollte verwendet werden, da auf einer weiß, wie diese könnte das Verfahren zu beeinflussen.
- Verwenden Sie 0,05 ml der Spermien / Milch-Mix pro Weibchen
Empfänger Weibchen
- Sie Vaginalabstrich auf Empfänger Weibchen (bis zu diesem Zeitpunkt den Empfänger Weibchen sollten in Proöstrus / Östrus werden)
- Frauen, die nicht Östrus wurden von Tag 5 erreicht, sollten Sie vielleicht nicht verwendet
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Acknowledgments
Ich möchte Mike Dewey vom Peromyscus Genetic Stock Center für seine wertvolle Einblicke, Geduld und Wissen auf Nagetier-Reproduktion zu danken.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-772-30 | |
| 18 G needle | Tool | BD Biosciences | 305195 | |
| Powdered milk | Reagent | Any Supplier | ||
| 1 mL syringe | Tool | National Scientific Company | S7510-1 | |
| Forceps | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5060 | |
| Scissors | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5882 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14200-075 | |
| 22 G blunt needle | Tool | Give to me |
