Vomeronasal 상피의 Multielectrode 배열 레코딩

Summary

Multielectrode 어레이 (MEA) 녹음 뉴런의 대규모 인구의 전기적 활동을 연구하는 방법을 제공합니다. 여기, 우리는 동시에 조직을 자극하는 동안 마우스 vomeronasal 상피에서 기록 MEA 준비의 세부 사항을 제시한다.

Abstract

신경 회로를 이해하는 것은 방법이 동시에 여러 뉴런에서 기록해야합니다. 에

Protocol

1 부. 전기 녹음 계측

1. 우리는 실리콘 질화물과 절연 10 μm의 평면 티타늄 질화물 전극과 평면 multielectrode 배열을 (에이러 과학 악기)을 사용합니다. 60 전극 30 μm의 중심 - 투 - 중심 간격 5x6 격자로 이루어진 두 분야로 정렬됩니다. (다른 구성도 가능합니다, 직경 녹음 표면에 10 μm의와 전극은 단일 뉴런의 활동을 격리의 관점에서 큰 전극보다 수 있습니다.)
2. 전기 신호는 MEA 1,060 앰프 (에이러 과학 악기)를 사용 (1000x 증폭) 증폭됩니다. 신호는 데이터 수집 카드 (내쇼날 인 스트 루먼트) 및 사용자 정의 데이터 수집 소프트웨어 (하나도 상용 소프트웨어를 구입할 수 있습니다)를 사용하여 10 kHz에서에서 찾았습니다.
3. 조직은 MEA의 문화 관 반지 안쪽 snugly 맞는 사용자 정의 삽입에 연결된 나일론 메쉬 (53 μm의)에 의해 MEA 아래로 개최됩니다.

2 부. 액체 배달 계측

1. 조직은 우리가 링어의 솔루션 (115 MM 나트륨 염화물, 5 MM 염화칼륨, 2 MM의 염화칼슘, 2 MM 마그네슘 염화물, 25 MM 나트륨 중탄산염, 10 MM HEPES, 10 MM D - (+를 제공하여 보증 지속 superfusion을 필요로 HPLC 펌프에서) - 포도당). 자극은 HPLC 밸브에 주입을 수행하고 -를 통해 흐름과 루프 사이의 전환에 의해 제공됩니다. HPLC 펌프 및 사출 로봇 주사기 펌프 모두 링어의 솔루션을 제공하고 있습니다.
2. 링어의 솔루션은 실험을하는 동안 42 온수 물을 욕조 (ISOTEMP 105) ° C에 보관하고 지속적으로 95% O ₂ / 5% CO _2와 함께 부풀어 오른 모양이다. 포도당없이 링어의 별도의 플라스크는 주사기 펌프를 백업을위한 준비가되어 있습니다. 링어의 솔루션은 3 ML / 분 속도로 307 HPLC 펌프 (길슨)를 사용하여 조직에 배달됩니다. 전형적인 5~6시간 실험에서 각 링어의 솔루션 1 L은 충분합니다.
3. 실험을하는 동안, 조직은 지속적으로 37 ° C 링어의 솔루션을 superfused입니다. 히터 프로브 직접 조직 위에 위치합니다.
4. 자극은 길슨 215 액체 처리기 로봇 팔을 사용하여 전달됩니다. 자극은 고무 덮인 유리 튜브에 저장하고, 일정한 유속과 압력이 유지되는 동안 길슨 소프트웨어의 통제, 로봇 팔 재관류 라인에 자극을 제공하고 있습니다.
5. HPLC 밸브 (루프 약혼 / 약혼하지 않음)의 상태의 연결 활동으로 동기화를 보장하기 위해 별도의 채널로 수집 컴퓨터에 의해 기록됩니다 전기적 전압으로 표시됩니다.

부 3. MEA와 자극 전달 장치를 준비

1. 전에 절개를 수행하기 위해 상온에서 최소 5 분 dH2O의 BSA와 잘 MEA를 입력합니다.
2. 따뜻한 - 부풀어 오른 링어의 솔루션을 사용하여 MEA를 씻어 얼음에 MEA를 놓으십시오.
3. 프라임 액체 처리기와 HPLC는 제조 업체의 지시에 따라 펌프.

부 4. VNO의 해부

1. 절개를 수행하기 전에, 얼음에 부풀어 오른 링어의 솔루션 및 장소 2 60x15 mm 배양 접시를 입력하십시오. 또한 얼음 링어의 솔루션과 장소에서 동일한 크기의 2 Sylgard 코팅된 배양 접시를 입력하십시오. 해부하는 동안 사용하기 위해 따뜻한 부풀어 오른 링어의 추가 50mL를 풀어.
2. 마우스는 자궁 전위 다음 CO ₂ 질식을 통해 희생이다.
3. 머리의 뒤쪽에, 턱 라인에 평행하게 실행 입의 측면에서 양국 incisions하십시오. 목 뒤에 따라 2 상처에 참여하고 마우스에 부착된 아래턱을두고, 머리 등의 부분을 제거합니다.
4. 좋은 가위를 사용하여 조직과 뼈가에서 조직을 분리 위턱 뼈의 양쪽 사이 했네요.
5. 비강을 폭로하는 미각의 조직에서 껍질, # 3 포셉을 사용합니다.
6. 작은 가위 또는 뼈를 vomeronasal 캡슐을 무료로 사이의 상단이 앞니의 양쪽에 상처 메스를 사용합니다.
7. # 3 포셉을 사용하여 얼음에 페트리 접시에있는 평면 골과 장소로 vomeronasal 캡슐을 선택합니다. 최대 집중을 통해 단계는 3보다 분 이내에 수행되어야합니다.
8. 반사광과 조명 stereomicroscope 아래 접시를 놓으십시오. # 3 포셉를 사용하여 한 번에 한 VNO에서 뼈다귀 캡슐을 제거합니다. , 멀리 VNO에서 뼈 껍질에 꼬리 끝 및 다른 손에서 재밌 VNO을 손상하지 않도록주의를 취하여 뼈에 캡슐을 안정화시키기 위해 한 손으로를 사용합니다.
9. 뼈가 제거되면 Sylgard 코팅 페트리 접시에 VNO을 전송하기만하면됩니다. 다른 VNO에 대해 남아있는 요리를 사용합니다. 전송 빛을 조명을 전환합니다.
10. 마이크로 가위 또는 # 5 포셉를 사용 VNO의 가장자리 절단하여 혈관에서 VNO를 구분한다. 이 시점에서 당신 것입니다완전히 혈관에서 분리 신경 시트 수 있습니다.
11. 내부 (돌기) 측면까지 함께 VNO를 놓습니다. # 3 포셉 사용하여 조직의 모서리에있는 Sylgard에 VNO를 앵커. 클램프와 함께 개최되는 테플론 코팅 면도날의 작은 조각을 사용하여 기초 라미나에서 신경 상피 껍질. 얕은 각도 (<30 ° 그릇 표면에서)에서 칼날을 개최하는 것이 가장 좋습니다.
12. 유리 피펫을 사용하여 MEA로 요리에서 신경 상피의 조각을 전송합니다. 최대 돌기 면을 전극 필드 위에 VNO를 놓습니다. 피펫과 초과 링어의 솔루션을 제거합니다. 장소에 VNO를 개최하고, 냉장 링어의 솔루션을 작성하기 위해 배열의 잘에 메쉬 조직 홀더를 놓습니다.

제 5 부. 녹음

1. MEA 1,060 증폭기의 MEA를 삽입하여 직접 조직 위의 히터 프로브를 위치.
2. 적절한 히터 프로브 위치를 확인하려면, 링어의 솔루션은 2 초 50 MM의 칼륨을 (몰 나트륨에 대한 대체) 포함과 자극. 칼륨 용액에 신경 응답의 지연 시간을 최소화하기 위해 위치를 조정합니다.
3. 이전에 조직이 적응 수 있도록 녹화 45 분 1 시간 온수 링어의 솔루션으로 조직을 Superfuse.
4. 전기 신호는 사용자 정의 레코딩 소프트웨어를 사용하여 디스크에 저장됩니다.

6 부. 데이터 분석

1. 오프라인 데이터 분석은 원시 전극 기록을 사용하여 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 특정 리간드에 대한 응답으로 기록된 세포의 발사 속도 변화를 측정합니다. 그 결과 데이터 세트는 대형이며, 다양한 질문을 해결하는 데 사용할 수있는, 프로그래밍이나 분석 언어 (C, Matlab, R, 파이썬, 또는 이와 유사한 것)과 친숙이 필요합니다.

7 부. 대표 결과

이 준비는 일반적으로 데이터 (60 전극에서 기록 6 시간)의 대량 항복, 6 시간 동안의 기록 정도로 안정됩니다.

그림 1. 배열의 절반에 걸쳐 동시 활동의 스냅샷이 표시됩니다. 시간 창 400 MS에 걸쳐. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 2. 전형적인 실험에서는, 우리는 10 초 동안 관심의 특정 화합물과 자극. 이 추적은 100 배 희석 여성 마우스 소변에 대한 응답의 예입니다. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

Discussion

Multielectrode 배열 레코딩은 우리에게 뉴런의 큰 인구의 동시 활동을 모니터링하는 능력을 허용합니다. 이것은 특히, VNO를 감각 시스템의 속성을 탐색을위한 유용한 도구입니다. 메인 후각 시스템과는 달리, VNO는 액상의 자극을 감지합니다. 또한, VNO는 이질적인 조직이다. 아마도 다른 응답 프로필 마우스 ¹ 수용체의 약 300 종류가 있습니다. 로봇 팔을와 결합된 MEA 레코딩은 우리가 안정적으로 뉴런과 electrophysiologically 정체성 응답의 크고 다양한 인구 액체 자극을 제공할 수 있습니다. 또한, 체외에서 VNO의 안정성은 자극의 여러 반복을위한 시간을 허용합니다.

이전,이 기술은뿐만 아니라 소변 ³ 현재 각 리간드를 확인하는 신뢰할 수있는 분석의 역할로 ² 마우스 소변에 대응 VSNs의 감각 특성을 조사하기 위해 사용되고 있습니다. 앞으로이 기술은 고도로 추가 리간드 발견에 유용하고 VNO의 감각 특성을 특성화에있을 수 있습니다.