Summary
هذا الاختبار يقيم قدرة جزيء الإشارة ، هنا تخلقية بروتين العظام 7 (BMP7) ، إلى إعادة توجيه محاور صواري. هو مثقف لازدراع من الحبل الشوكي الجنينية الظهرية المتاخمة لمجموع إفراز الخلايا COS عوامل النمو مرشح. المحاوير صواري توجيه المتزايد داخل يزدرع هي التي تصور المناعية.
Abstract
وقد المحاوير صواري الظهري في النخاع الشوكي الفقاريات 1 نظام النموذج الذي لا يقدر بثمن في توجيه اشارات لتحديد محور عصبي. هنا ، نحن تصف في الفحص المختبري "، ومقايسة إعادة توجيه" ، التي استخدمت على نطاق واسع لدراسة تأثير خارجي من الإشارات والجوهرية في اتجاه المحاور صواري 2. وقد تم تطوير هذا الاختبار من قبل عدد كبير من الناس في مختبرات دود جين توماس وJessell ومسدين اندرو (انظر الاعترافات لمزيد من التفاصيل) وكانت تستخدم الإصدارات من هذا الاختبار للتدليل على أنشطة إعادة توجيه جزيئات مفتاح التوجيه محور عصبي ، بما في ذلك BMP في chemorepellent صفيحة سقف 3،4 والأنشطة chemoattractive من Netrin1 5 و القنفذ الصوتي (SHH) 6 في لوحة الكلمة في الحبل الشوكي.
وتضم تشريح Explants 2-3 شرائح من ثلثي الظهرية للنخاع من يوم الجنينية (E) 11 الفئران والمثقفين في ثلاثة المواد الهلامية الكولاجين الأبعاد 7. explants E11 العمود الفقري الظهري يحتوي على الخلايا العصبية صواري المولود حديثا ، والتي يمكن تحديدها من خلال التعبير عنها محواري من بروتين سكري ، Tag1 8. على مدار ساعات 30-40 في الثقافة ، ولخص مسار محوار صواري في هذه explants الظهرية مع دوام شبيهة بتلك التي شوهدت في الجسم الحي. يمكن الطعن في هذا المسار من خلال وضع محواري الأنسجة إما اختبار أو التجميعية الخلية COS معربا عن جزيء مرشح يشير في اتصال مع واحدة من الحواف الجانبية للازدراع الظهرية. وسوف تمتد صواري المحاور في المنطقة المجاورة للأنسجة إلحاق تنمو تحت تأثير كل من لوحة السقف الذاتية وإشارات من الأنسجة الجانبي خارج الرحم. ويمكن قياس درجة التي يتم توجيه المحاوير صواري في ظل هذه الظروف. باستخدام هذا الاختبار ، فمن الممكن على حد سواء لفحص مدى كفاية إشارة خاصة إلى إعادة توجيه محاور صواري 3،4 فضلا عن ضرورة هذا إشارة لتوجيه مسار صواري 9.
Protocol
الجزء 1 : إعداد الركام من الخلايا COS Transfected باستخدام قطرة الشنق
- COS - 7 البذور (COS) الخلايا في أطباق ثقافة 35mm. عندما تصل إلى 80 ٪ confluency ، 1μg transfect التعبير البلازميد في الخلايا باستخدام Lipofectamine2000 وفقا لبروتوكول الصانع ق.
- لإعداد شنقا قطرات ، نضح في والمتوسطة ترنسفكأيشن شطف transfected COS 1ml من الخلايا مع حلول التخزين المؤقت 1X الفوسفات (PBS). علاج الخلايا مع 0.5ml من انزيم خالية من الخلايا تفارق المتوسطة لمدة 15 دقيقة. إضافة 1ml من محلول OPTI - MEM المصل + + 1X البنسلين / الستربتوميسين / الجلوتامين (P / S / G) 10 ٪ بقري جنيني (FBS) لمنعها من التفاعل.
- متمزج الخلايا لإزالتها من على سطح الطبق والثقافة ، ونقل إلى أنبوب مخروطي 15ml. تدور لمدة 2 دقيقة في 2000K إلى خلايا بيليه. إزالة وطاف بيليه resuspend في 100μl من OPTI - MEM 1X + P / S / G FBS 10 ٪ +.
- بقعة قطرات 20μl متعددة في الداخل غطاء صحن الثقافة 35mm ، عكس غطاء ووضعت على رأس الجزء السفلي من صحن وتترك في الحاضنة 37 درجة مئوية لعدة ساعات حتى خلايا الكلي.
الجزء 2 : إعداد الظهرية Explants النخاع الشوكي
- تشريح أجنة الفئران E11 من رحم الأم والحفاظ على الجليد في L15 المتوسطة لحين الحاجة إليها.
- بإبرة التنغستن شحذ ، وإزالة قسم من الجزء 4-6 جذع كل جنين ، من المنطقة فورا دون تبرعم forelimb. باستخدام ماصة بلاستيكية ، وجمع القطع الأنسجة في بئر واحدة من صحن 4 - نونك جيدا والحفاظ على الجليد.
- عندما تم تشريح جميع شرائح الجنين ، استخدم ماصة بلاستيكية لنقل القطع إلى حل 1ml L15 + 1mg dispase في الثانية بشكل جيد للطبق نونك. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تزيد مدة 5 دقائق. لا يحضن على قطع الأنسجة مع dispase.
- أثناء الحضانة ، إضافة 0.5ml من مصل الماعز المعطل الحرارة العادية (HIGS) إلى نحو 10ML من L15 في طبق بتري ودوامة لالمزيج. نقل 1ml من هذا الحل في 1 / 3 جيد للطبق نونك ونقل قطعة النسيج في هذا الحل عندما انتهت الحضانة. تبقي على الجليد. ملاحظة : تشريح لاحقة سوف يكون أسهل إذا ما سمح للقطعة النسيج الى "الراحة" على الجليد لمدة ساعة.
الجزء 3 : الكولاجين الاشعال
- إضافة 10X الحد الأدنى 40μl الوسيلة الأساسية ل360μl الكولاجين ، مزيج بسرعة وبدقة من قبل لفترة وجيزة vortexing عبها أو الأنبوب. تدور بسرعة في أسفل picofuge. وسوف يكون الحل الأصفر حافظ على الجليد قدر الإمكان.
- بيكربونات الصوديوم إضافة يكفي 0.8M (NaHCO 3) لتحويل حل الكولاجين البرتقالي قليلا (انظر الملاحظة أدناه). مرة أخرى ، مزيج بسرعة وبدقة من قبل عبها ، وتدور باستمرار لفترة وجيزة في picofuge. إذا كان هذا الحل يبقى الوردي بعد الاختلاط ، قمت بإضافة الكثير من NaHCO (3) وسوف تحتاج إلى البدء من جديد مع أنبوب جديدة من الكولاجين.
- عند هذه النقطة هو معبي الحل الكولاجين. وسوف تظل سائلة على الجليد ، ولكن سوف يصلب ضمن حوالي 5 دقائق (تحول الوردي) عند تقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة.
- 20μl بقعة من الكولاجين في كل بئر من صحن 4 - جيدا نونك. استخدام غيض من ماصة الخاص ، انتشرت لتشكيل الكولاجين الصغيرة "وسادة". السماح للالكولاجين وضعت في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة : إن المبلغ المحدد للNaHCO 3 سوف تحتاج إلى معاير لكل دفعة من الكولاجين. بدء منخفضة (11μl) ثم إضافة 0.5 1μl متدرج حتى الحل هو الظل طفيف من البرتقال. "الحق" المبلغ هو عادة 1ul أقل من أصغر مبلغ 3 NaHCO التي من شأنها أن تحول الوردي الكولاجين. كمية NaHCO 3 لا مقياس خطيا صعودا أو هبوطا.
الجزء 4 : تشريح الظهرية Explants الحبل الشوكي وضعية لهم خلية الركام في مصفوفة COS الكولاجين
- باستخدام إبرة التنغستن شحذ حديثا وزوج من غرامة ملقط (# # 5 أو 55) ، إزالة الأديم المتوسط المحيطة الحبل الشوكي.
- خفض مواز لوحة الكلمة مع الإبرة التنغستن وإزالة بعناية الخامس بطني من الحبل الشوكي.
- شطر من يزدرع الظهرية الشوكي ، والتأكد من أن يتم قطع حواف نظيفة كما ممكن. إعادة تقليم الحواف ، إذا لزم الأمر. نقل كل يزدرع الفقري الظهري على منصات منفصلة باستخدام الكولاجين الفم ماصة مزودة أنبوب زجاجي الشعرية وانسحبت إلى تقريبا. 0.5mm في القطر.
- خفض مجموع الخلايا COS transfected في ساحات العرض تقريبا نفس الحافة الجانبية لازدراع الشوكي الظهرية.
- نقل واحد من هذه الميادين على لوحة الكولاجين مع يزدرع الشوكي الظهري ، وذلك باستخدام ماصة الفم.
- ماصة مع الفم ، ونضح إيقاف أي السائل الزائد باستخدام ماصة الفم. لا أكثر من نضح.
- تطبيق 4μl الكولاجين معبي تستقر على الوسادة ، وباستخدام إبرة التنغستن، نقل على الكولاجين explants مباشرة دون لمس الأنسجة. عن طريق تحريك الإبرة التنغستن في الكولاجين المحيطة explants ، explants توجيه بحيث أن مجموع الخلايا COS المجاورة لحافة الوحشي يزدرع الشوكي الظهرية.
- بعد الكولاجين وضعت ، كرر تطبيق 4μl الكولاجين لضمان أن يتم explants المغطى تماما في الكولاجين.
- في نسيج الثقافة هود ، إضافة 0.5ml من 1xP/S/G + OPTI - MEM والثقافة لساعات 30-40.
- explants الإصلاح لمدة 45 دقيقة مع 0.5ml بارافورمالدهيد 4 ٪ في 1xPBS ، والحفاظ على لوحة على الجليد.
- تغسل مرتين مع 0.5ml حل حجب 1xPBS + 0.1 ٪ تريتون - X100 HIGS +1 ٪ (PBTN). كتلة عند 4 درجة مئوية لمدة بضع ساعات على الأقل ، ويفضل الحضانة بين عشية وضحاها ومن ثم العملية المناعية.
الجزء 5 : التصور من محاور عصبية صواري بواسطة المناعية
- بعد حظر في PBTN ، قطع explants للخروج من لوحة 4 بشكل جيد مع ملقط ووضعها في صحن 48 أيضا.
- إضافة 200μl الأجسام المضادة الأولية إلى كل بئر وترك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. لتصور المحاوير صواري ، استخدام حل 01:06 من الأجسام المضادة لمكافحة Tag1 الماوس. لتحديد ما إذا كان ترنسفكأيشن كانت ناجحة ، وتشمل أيضا الأجسام المضادة الأولية التي يجري اختبارها ضد أي جزيء إشارة أو حاتمة ذات الصلة إذا كان جزيء يشير حاتمة المفتاحية.
- يغسل كل عينة لمدة 5 ساعات في 1 × PBTN في 4 درجات مئوية.
- إضافة 200μl من الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر وترك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. إذا كانت تستخدم لمكافحة Tag1 الأضداد والأجسام المضادة الأولية ، واستخدام الماوس الماعز الغلوبولين المناعي الأجسام المضادة الثانوية المضادة بالإضافة إلى إما FITC أو Cy3. إذا باستخدام ضوء الأجسام المضادة الثانوية بالإضافة إلى FITC الحساسة أو Cy3 ، والحفاظ على طبق ال 48 المشمولة في احباط جيدا من هذه النقطة.
- يغسل كل عينة 5 × 1 ساعة في كل PBTN في 4 درجات مئوية.
- نقل يزدرع إلى شريحة الاكتئاب 3 - جيدا ، وإزالة السائل الزائد ، جبل في وسط Vectashield وساترة. متجر في مربع آمن في ضوء إما 4 أو درجة مئوية -20 درجة مئوية.
الجزء 6 : صور ممثل Explants
في تجربة ناجحة ، وسوف يزدرع التجميعية COS تبقى المجاورة لبعضها البعض وعدم الانجراف بعيدا مثل الكولاجين مجموعات. لن يكون هناك نمو زائد الحد الأدنى من المحاور ؛ فرط محواري كبيرة تشير إلى أنه تم تربيتها في العمود الفقري الظهري يزدرع لفترة طويلة جدا. لن يكون هناك الفقاعات متزايدة من يزدرع ؛ blebbing يحدث إذا النسيج يأتي في اتصال مباشر مع الثقافة المتوسطة.
ويتم تقييم قدرة جزيء يشير إلى إعادة توجيه محاور مبائر باستخدام المجهر. ويمكن قياس مدى إعادة توجيه محور عصبي عن طريق قياس زاوية متوسط إعادة توجيه المحاور الأقرب إلى تجميع الخلية COS 3. كما هو مبين في الشكل 1 ، معربا عن الخلايا COS myc الموسومة BMP7 (الأزرق) + إعادة توجيه Tag1 المحاوير صواري (الأخضر) بعيدا عن مصدر BMP7 (1B الشكل) مشابهة للطريقة التي تعتبر أن لوحة يزدرع سقف يصد المحاوير صواري (الشكل 1A). خلايا COS تعبر عن مكافحة ناقلات يكون له تأثير على اتجاه المحاور صواري 3،4. كما وصفت هذه explants مع الأجسام المضادة لعامل النسخ Isl1 / 2 (الحمراء) ، الذي يزين الخلايا العصبية الحركية وinterneurons الظهرية. وبهذه النتيجة أول إشارة إلى أن أحد أعضاء الأسرة يتوسط BMP نشاط سطح اللوحة chemorepellent 3.
الشكل 1 : الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
العوامل الحاسمة التي تحدد النجاح في أداء هذا الاختبار هي أولا ، لا ينبغي أن تعامل مع الأنسجة dispase لفترة طويلة جدا ، وسوف ينتج مثل هذه المعاملة في النسيج تصبح لزجة جدا وبعد أن انخفضت قدرتها على البقاء. اثنين ، يجب أن تكون الكولاجين تستعد تماما ويحرص على الجليد قدر الإمكان. وسوف يصبح من الصعب على نحو متزايد لمعالجة إذا كان يبدأ في مجموعة ، أي تحويل الوردي. ثلاثة ، يجب دائما أن تبقى التنغستن إبرة حادة جدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وقد تم تطوير هذا البروتوكول في مختبرات دود جين توماس وJessell ومسدين اندرو. قرر العديد من الناس ، بما في ذلك باسلر كونراد ، Calof آن ، Edlund توماس هاملتون فيل ، Karagogeos دومنا ، ارييل رويز Altaba ط ويامادا Toshiya كيفية explants ثقافة النخاع الشوكي في الكولاجين. رائدة Marysia Placzek ومارك لافين تيسييه - باستخدام تقنية النمو في محور عصبي من explants المختبر كوسيلة لتحديد الجزيئات التوجيه محور عصبي. ويدعم العمل في المختبر بتلر من المنح المقدمة من مارس من الدايمات وNS063999 R01 من المعاهد الوطنية للصحة / NINDS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type 1 rat tail collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| 10x Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11430-030 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 51985-034 | |
| L15 | Invitrogen | 11415-064 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1166-8019 | |
| Fetal bovine serum | Mediatech, Inc. | 35-016-CV | |
| Cell dissociation solution | EMD Millipore | S-004-C | |
| Trypsin 0.25% EDTA | Invitrogen | 2520-0056 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Pen/Strep/Glutamate | Invitrogen | 10378-016 | |
| Paraformaldhyde | Baker/VWR | JTS898-7 | |
| Dispase | Roche Group | 10241750001 | |
| mouse anti Tag1 IgM (4D7) | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| mouse anti Myc IgG (9E10) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-40 | |
| goat anti mouse IgM FITC | Jackson | 115-095-075 | |
| goat anti mouse Fcy Cy3 | Jackson | 115-165-071 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210064 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 4 well Nunclon dish | Nalge Nunc international | 62407-068 | |
| 3 well depression slide | VWR international | 48339-009 | |
| 48 well dish | Falcon BD | 62406-195 | |
| Aspirator tuve assembly | FHC, Inc. | 30-32-0 | |
| #55 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| #5 Dumont forcept | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 26016-12 |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , Springer. Clifton, N.J. 461 vol 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A. BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons. Neuron. 24, 127-141 (1999).
- Butler, S. J., Dodd, J. A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons. Neuron. 38, 389-401 (2003).
- Kennedy, T. E., Serafini, T. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78, 425-435 (1994).
- Charron, F., Stein, E. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. 113, 11-23 (2003).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Dodd, J., Morton, S. B. Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons. Neuron. 1, 105-116 (1988).
- Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions. Development. 135, 1119-1128 (2008).
