Этот тест оценивает способность сигнальной молекулы, здесь костные морфогенетические белки 7 (BMP7), переориентировать спаечный аксонов. Эксплантов эмбриональной спинной спинного мозга выращиваются прилегающих к совокупности COS клетки, секретирующие факторы роста кандидата. Переориентация спаечный аксонов, растущее внутри эксплантатов визуализируются по иммуногистохимии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Опробование Способность к диффузии сигнальных молекул переориентировать Эмбриональные спинного спаечный Аксоны
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Спинной спаечный аксонов в спинном мозге позвоночных 1 были неоценимую системы модель, в которой для выявления сигналов аксонов руководства. Здесь мы описываем в пробирке анализ ", переориентация анализа", который широко используется для изучения влияния внешних и внутренних сигналов от ориентации спаечный аксонов 2. Этот анализ был разработан многочисленный народ в лабораториях Джейн Додд, Томас Jessell и Эндрю Ламсден (см. благодарность за более подробной информацией) и версии данного анализа были использованы для демонстрации переориентации деятельности ключевых молекул, руководство аксонов, в том числе БМП chemorepellent в потолочной панелью 3,4 и chemoattractive деятельности Netrin1 5 и Еж Соник (SHH) 6 в пол пластины в спинном мозге.
Эксплантов включающий 2-3 сегментов спинного две трети спинного мозга расчлененное из эмбриональных день (E) 11 крыс и культивировали в трехмерном гели коллагена 7. E11 спинной спинного эксплантов содержать новорожденного спаечный нейронов, которые могут быть идентифицированы по их аксонального выражение гликопротеин, Tag1 8. В течение 30-40 часов в культуре, спаечный траектории аксона воспроизводятся в этих спинной эксплантов со временем конечно же, увидеть в естественных условиях. Это аксонального траектория может быть обжаловано путем размещения либо тест ткани или совокупности COS ячейки выражения кандидата сигнальной молекулы в контакте с одной из боковых краев спинной эксплантов. Спаечный аксонов расширения в непосредственной близости от добавляется ткань будет расти под влиянием как эндогенных пластины крыши и сигналы от внематочной боковой ткани. Степень, в которой спаечный аксоны переориентированы в этих условиях могут быть определены количественно. С помощью этого теста, можно и рассмотреть достаточность определенный сигнал для переориентации спаечный аксонов 3,4, а также необходимость для этого сигнала, чтобы направить спаечный траектории 9.
Протокол
Часть 1: Подготовка агрегатов трансфицированных клеток COS использованием висячие капли
- Семенной COS-7 (COS) клеток в 35 блюдах культуры. Когда они достигают 80% слияния, трансфекции 1 мкг выражения плазмиды в клетки с помощью Lipofectamine2000 в соответствии с протоколом производителя с.
- Для подготовки висят капли, аспирация трансфекции средних и промыть трансфицированных клеток COS с 1 мл 1 раз фосфатным буферным раствор (PBS). Лечить клеток с 0,5 мл фермента без клеточной диссоциации среду в течение 15 минут. Добавить 1 мл раствора Opti-MEM + 1x пенициллина / стрептомицина / Глютамин (P / S / G) + 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), чт....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Критические факторы, которые определяют успех в выполнении этого теста во-первых, ткань не следует относиться с dispase слишком длительного периода, такое лечение может привести к ткань становится очень липким и снизившись жизнеспособность. Два, коллагена должны быть идеально загрунтовать и держится на льду как можно больше. Она будет становиться все более трудно справиться, если он начинает устанавливать, то есть становятся розовыми. Три, вольфрамовой иглы всегда должны быть очень острыми.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Этот протокол был разработан в лабораториях Джейн Додд, Томас Jessell и Эндрю Ламсден. Многие люди, в том числе Конрад Basler, Энн Calof, Томас Эдлунд, Фил Гамильтон, Домна Karagogeos, Ариэль Руис я Altaba и Toshiya Ямада определяется как культура эксплантов спинного мозга в коллагене. Марыся Плачека и Марк Тессье-Лавинь впервые методика использования аксон рост в пробирке из эксплантов в качестве средства идентификации молекул аксон руководства. Работа в Батлер лаборатории поддержана грантами марте Dimes и R01 NS063999 из NIH / NINDS.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Ссылки
- Altman, J., Bayer, S. A. The development of the rat spinal cord. , (1984).
- Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. Methods in molecular biology. , Springer. Clifton, N.J. 461 vol 325-335 (2008).
- Augsburger, A., Schuchardt, A.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Больше статей
