Summary
हाय - सी विधि chromatin बातचीत (1) के निष्पक्ष, जीनोम चौड़ा पहचान की अनुमति देता है. हाय - सी जोड़े निकटता ligation और व्यापक समानांतर अनुक्रमण. परिणामी डेटा के लिए एकाधिक पैमाने पर जीनोमिक वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: प्रारंभिक परिणाम गुणसूत्र क्षेत्रों, खुले और बंद chromatin के अलगाव, और megabase बड़े पैमाने पर chromatin संरचना के रूप में ऐसी सुविधाओं की पहचान की.
Protocol
इस विधि में रिपोर्ट अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया था Lieberman - Aiden, एट अल. विज्ञान 326, 289-293 (2009) .
मैं Crosslinking, पाचन, डीएनए समाप्त होता है के चिह्नित, और ब्लंट अंत Ligation
- हाय - सी कोशिकाओं है, जो सभी 3C आधारित विधियों के बीच एक आम धागा है crosslinking के साथ शुरू होता है. शुरू करने के लिए, 2 x 10 7 और 2.5 x 10 7 स्तनधारी कोशिकाओं के बीच हो जाना, या तो अनुयायी या निलंबन में, और कोशिकाओं crosslink. (कक्षों की crosslinking पर जानकारी के लिए, कृपया देखें: 11
- 550 μl lysisbuffer में कोशिकाओं lyse (500 μl 10 मिमी Tris - एचसीएल 8.0 पीएच, 10 मिमी NaCl, 0.2% Igepal CA-630 और 50 μl protease inhibitors) एक homogenizer का उपयोग. 5000 rpm पर chromatin घुमाओ और गोली 500 μl 1x 2 NEBuffer के साथ दो बार धोने.
- 1x 2 NEBuffer, विभाज्य में 5 गिने ट्यूबों में chromatin और Resuspend 362 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए 1x 2 NEBuffer जोड़ने. 38 μl एसडीएस 1% जोड़ें, ध्यान और मिश्रण 10 मिनट के लिए 65 ° सी में सेते हैं. बर्फ पर वापस ऊष्मायन के तुरंत बाद ट्यूबों रखें.
- एसडीएस 44 μl X-100 ट्राइटन और ध्यान से मिश्रण को जोड़कर बुझाने. 37 पर HindIII और सेते की 400 इकाइयों डिग्री सेल्सियस रातोंरात जोड़ने जबकि घूर्णन द्वारा chromatin डाइजेस्ट.
- अगले कदम हाय - सी विशिष्ट हैं और डीएनए अंकन शामिल बायोटिन और कुंद अंत Crosslinked टुकड़े के ligation के प्रदर्शन के साथ समाप्त होता है. यह कदम ligation जंक्शनों बाद शुद्ध करने के लिए अनुमति देगा. 1 ट्यूब biotinylation कदम से गुजरना नहीं और इसके बजाय अलग रखा जाना चाहिए चाहिए और एक 3C नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए कि पाचन सुनिश्चित करने के लिए, और ligation शर्तों इष्टतम थे.
- प्रतिबंध टुकड़ा overhangs में भरने और निशान डीएनए शेष 4 ट्यूब में बायोटिन के साथ समाप्त होता है, 1.5 μl 10 मिमी dATP, 1.5 μl 10 मिमी dGTP, 1.5 μl 10 मिमी dTTP, 37.5 μl 0.4 मिमी बायोटिन-14-dCTP जोड़ने, और 10 μl 2-5 ट्यूबों 5U/μl Klenow. सावधानी मिक्स और 37 पर 45 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
- बर्फ पर ट्यूबों रखें. एंजाइमों निष्क्रिय, 1-5 ट्यूबों के लिए 86 μl 10% एसडीएस जोड़ने. 65 में ट्यूब ° ठीक 30 मिनट के लिए सी और सेते हैं बर्फ पर उन्हें तुरंत बाद जगह.
- ligation बेहद पतला शर्तों के तहत किया जाता है क्रम में Crosslinked टुकड़े के बीच ligation की घटनाओं के पक्ष में है. बर्फ पर कार्य, 7.61 मिलीलीटर ligation मिश्रण 745 [μl 10% Triton एक्स-100, 745 μl 10x ligation बफर (500 मिमी Tris - एचसीएल 7.5 पीएच, 100 मिमी 2 MgCl, 100 मिमी डीटीटी), 80 μl 10 BSA मिलीग्राम / एमएल जोड़ने 80 μl 100 मिमी एटीपी और 5.96 मिली लीटर पानी पांच साल की प्रत्येक के लिए] 15 मिलीलीटर ट्यूबों गिने. एक इसी 15 मिलीलीटर ट्यूब प्रत्येक पचा chromatin मिश्रण स्थानांतरण.
- नियमित रूप से 3C ligation के लिए, ट्यूब 1 10 μl 1U/μl टी -4 डीएनए ligase जोड़ें. कुंद अंत ligation हाय-C के लिए, 2-5 ट्यूबों 50 μl 1U/μl टी -4 डीएनए ligase जोड़ें. Inverting ट्यूबों द्वारा मिक्स और 16 में 4 घंटे के लिए सभी 5 ट्यूबों सेते डिग्री सेल्सियस
- Crosslinks उलट रहे हैं और ट्यूब प्रति 50 μl 10 मिलीग्राम / एमएल proteinase कश्मीर जोड़ने और ट्यूबों 65 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात incubating द्वारा अपमानित प्रोटीन है अगले दिन ट्यूब प्रति एक अतिरिक्त 50 μl 10 मिलीग्राम / एमएल proteinase कश्मीर जोड़ें और 65 में ऊष्मायन जारी ° C एक और 2 घंटे के लिए.
- कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण कूल और उन्हें पांच 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों के लिए स्थानांतरण. इन ट्यूबों में एक phenol के निष्कर्षण प्रदर्शन से डीएनए शुद्ध. 10 मिलीलीटर phenol के पीएच 8.0 और 2 मिनट के लिए भंवर जोड़ें. ट्यूबों 3500 rpm पर 10 मिनट के लिए और ध्यान से स्पिन एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब के रूप में जलीय चरण के जितना संभव हस्तांतरण.
- Phenol 8.0 पीएच का उपयोग निष्कर्षण दोहराएँ: क्लोरोफॉर्म (01:01) और इथेनॉल का उपयोग डीएनए वेग. (डीएनए शुद्धि पर जानकारी के लिए, कृपया देखें: 11
- इथेनॉल के बाद centrifugation डीएनए उपजी, 450 μl 1x ते में प्रत्येक डीएनए गोली (10 मिमी Tris - एचसीएल पीएच 8.0, 1 मिमी EDTA) भंग. एक 1.7 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के डीएनए के मिश्रण स्थानांतरण.
- क्लोरोफॉर्म extractions: शुद्धि का दूसरा दौर 2 phenol कर रही द्वारा किया जाता है. क्लोरोफॉर्म (01:01) और 1 मिनट के लिए भंवर: 500 μl phenol 8.0 पीएच जोड़ें. 5 मिनट के लिए ट्यूबों 14,000 rpm पर अपकेंद्रित्र एक नया ट्यूब जलीय चरण हस्तांतरण. दूसरा निष्कर्षण के बाद, NaOAc 0.1x मात्रा, डिग्री सेल्सियस -80 पर 100% इथेनॉल और 30 मिनट सेते 2x मात्रा जोड़कर डीएनए वेग
- नीचे उपजी डीएनए कताई के बाद, 70% इथेनॉल के साथ प्रत्येक डीएनए गोली धोने और 25 μl 1x ते में प्रत्येक डीएनए गोली resuspend. किसी भी शाही सेना है कि एक μl 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर RNase एक प्रति ट्यूब जोड़ने और 37 पर 30 मिनट के लिए ट्यूबों incubating द्वारा उपस्थित हो सकता डिग्री सेल्सियस नीचा पूल 2-5 ट्यूबों के हाय - सी सामग्री, अभी भी 1 ट्यूब एक 3C नियंत्रण के रूप में अलग रखते हुए.
- अब हाय - सी अंकन और ligation दक्षता जांच के लिए एक अच्छा अवसर है. इन नियंत्रणों है कि क्या एक पुस्तकालय हाय - सी सफल होने जा रहा है के उत्कृष्ट संकेतक हैं.
- और पुस्तकालयों की गुणवत्ता और मात्रा की जांच करने के लिए, 2 μl और दोनों 3C और पुस्तकालयों हाय - सी से एक 0.8% agarose जेल पर 1:10 dilutions की 6 μl aliquots चलाते हैं. (चित्रा 2A देखें)
- हाय - सी अंकन और हाय - सी ligation दक्षता एक पीसीआर पचाने में परख द्वारा सत्यापित है. सफल भरने और एक HindIII साइट के ligation - (AAGCTT) प्रतिबंध एंजाइम NheI (GCTAGC) के लिए कोई साइट बनाता है. दो पास प्रतिबंध टुकड़े से गठित एक विशेष ligation उत्पाद पीसीआर के साथ परिलक्षित होता है (के रूप में 11 3C टेम्पलेट के रूप में प्रत्येक लायब्रेरी के 0.2 μl का उपयोग करने में पीसीआर उत्पादों को बाद में HindIII, NheI या दोनों के साथ पचा रहे हैं. 2% जेल पर नमूने को चलाने के बाद. , 3C और हाय - सी ligation घटनाओं के सापेक्ष संख्या में कटौती और काटा हुआ बैंड (चित्रा 2B) की तीव्रता बढ़ाता द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है.
- कुछ टुकड़े नहीं किया गया है ligated होगा: उन्हें नीचे खींच से बचने के बाद इन unligated टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ exonuclease गतिविधि का उपयोग कर समाप्त होता है से बायोटिन हटाने.
- गैर ligated डीएनए छोर पर बायोटिन-14-dCTP टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ exonuclease गतिविधि के साथ हटा दिया जाता है. 1 μl 10 मिलीग्राम / एमएल BSA, 10 μl 10x 2 NEBuffer, 1 μl 10 मिमी dATP, 1 μl 10 मिमी dGTP और 5 इकाइयों 100 μl की कुल मात्रा में टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ के साथ हाय-C लाइब्रेरी के 5 μg मिक्स और सेते 12 में मिश्रण ° सी 2 घंटे के लिए. यदि संभव हो तो एकाधिक 5 μg प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन कर रहे हैं.
- प्रतिक्रिया 2 μl 0.5 एम EDTA पीएच 8.0 जोड़ने के द्वारा बंद कर दिया है.
- क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण (01:01) इथेनॉल वर्षण द्वारा पीछा किया जाता है: डीएनए, phenol के पीएच 8.0 शुद्ध.
- सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया है और डीएनए छर्रों resuspended और 100 μl पानी की कुल मात्रा में जमा कर रहे हैं.
द्वितीय. आकार और चयन कर्तन
- Biotinylated डीएनए उच्च throughput अनुक्रमण के लिए उपयुक्त बनाने के लिए, डीएनए एक Covaris S2 के साधन के साथ 300-500 basepairs (कर्तव्य चक्र 5, 5 तीव्रता, चक्र / 200, 4 चक्र के लिए 60 सेकेंड समय फट) के आकार के sheared होना चाहिए .
- Sheared डीएनए समाप्त होता है की मरम्मत करने के लिए, 14 μl ligation 10x बफर, 14 μl 2.5 मिमी dNTP मिश्रण, 5 μl टी -4 डीएनए पोलीमरेज़, 5 μl टी -4 polynucleotide kinase, 1 μl Klenow डीएनए पोलीमरेज़ और 1 μl पानी जोड़ें. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- ऊष्मायन के बाद, एक Qiagen MinElute स्तंभ का उपयोग करने के लिए निर्माता की सिफारिशों के अनुसार डीएनए शुद्ध. 15 μl Tris कम EDTA (TLE: 10 मिमी Tris पीएच 8.0, 0.1 मिमी EDTA) 1x के साथ डीएनए दो बार Elute. फिर, 5 μl 10x NEBuffer2 जोड़ने, 10 μl मिमी 1 dATP, 2 μl पानी और 3 μl Klenow (exo) के द्वारा अंत मरम्मत डीएनए की छोर तक 3 'एक dATP देते हैं. 37 पर 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया सेते डिग्री सेल्सियस
- Klenow टुकड़ा निष्क्रिय करने के लिए, 65 में 20 मिनट के लिए प्रतिक्रियाओं सेते ° सी और बाद में बर्फ पर प्रतिक्रिया शांत. एक speedvac का उपयोग, 20 μl प्रतिक्रिया मात्रा को कम.
- अगला, 1X TAE के साथ एक 1.5% agarose जेल में डीएनए और लोड 80-90V पर 3.5 घंटे के लिए चला. SYBR हरे रंग के साथ जेल धुंधला हो जाना करने के बाद, एक DarkReader पर डीएनए कल्पना. आबकारी डीएनए टुकड़े के बीच 300 और 500 आधार जोड़े और उन्हें एक Qiagen जेल निष्कर्षण 2-4 जेल के वजन के आधार पर स्तंभों का उपयोग किट के साथ शुद्ध. 50 μl 1x TLE के साथ डीएनए Elute.
- Qiaquick स्तंभों से eluates का मिश्रण है और अंतिम मात्रा लाने 1x TLE के साथ 300 μl. अंत में, बल्ली से ढकेलना - यह परख के साथ डीएनए एकाग्रता qubit fluorometer का उपयोग का निर्धारण और डीएनए की कुल राशि की गणना.
III. बायोटिन नीचे खींचो और बनती - अंत अनुक्रमण
- प्रोटोकॉल के इस अनुभाग में, ligation जंक्शनों डीएनए पूल से शुद्ध कर रहे हैं, बनती अंत अनुक्रमण द्वारा chromatin टुकड़े बातचीत के कुशल पहचान के लिए अनुमति देता है. डीएनए LoBind ट्यूबों में सभी बाद के चरणों का प्रदर्शन.
- बायोटिन के लिए पुल से नीचे धोने 150 μl चुंबकीय streptavidin मोती 400 μl बीच बफर (: 5 मिमी Tris - एचसीएल 8.0 पीएच 0.5 मिमी, EDTA, 1 एम NaCl, 0.05% बीच टीबी) के साथ दो बार resuspended मोती तैयार.
ये और भविष्य washes के पांच चरणों से मिलकर बनता है:- मोतियों के लिए बफर जोड़ें
- एक नया ट्यूब मिश्रण स्थानांतरण
- 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना घुमाएँ
- मोती एक चुंबकीय कण concentrator का उपयोग को पुनः प्राप्त
- सतह पर तैरनेवाला निकालें
- 300 μl 2x No बीच बफर (2x NTB: 10 मिमी Tris - एचसीएल 8.0 पीएच, 1 मिमी EDTA, 2 एम NaCl) में मोती Resuspend और 300 μl डीएनए हाय - सी के साथ गठबंधन. डीएनए हाय - सी लेबल बायोटिन रोटेशन के साथ 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण incubating द्वारा streptavidin मोती करने के लिए बाध्य करने के लिए अनुमति दें.
- चुंबकीय कण concentr साथ streptavidin मोती बाध्य डीएनए को पुनः प्राप्तator और सतह पर तैरनेवाला हटायें. 400 μl 1x NTB (5 मिमी Tris - एचसीएल 8.0 पीएच 0.5 मिमी, EDTA, 1 NaCl एम), 100 μl 1x ligation बफर के द्वारा पीछा में मोती धो लें. 50 μl 1x ligation के बफर में मोती Resuspend और एक नया ट्यूब के मिश्रण हस्तांतरण.
- Illumina बनती अंत अनुक्रमण के लिए डीएनए तैयार करने के लिए, बायोटिन पुल से नीचे है, जो पहले 2.6 चरण में गणना की गई के लिए इनपुट के रूप में इस्तेमाल किया डीएनए की कुल राशि ले, और यह 20 से विभाजित करने के लिए हाय - सी डीएनए की राशि का अनुमान है कि नीचे खींच लिया और ligation के लिए उपलब्ध है. Illumina बनती हाय - सी ligation के लिए उपलब्ध डीएनए के μg प्रति अंत एडेप्टर के 6 picomoles जोड़ें. 1200 इकाइयों टी -4 डीएनए ligase का प्रयोग करने के लिए डीएनए के लिए एडाप्टर ligate. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते हैं.
- हाय - सी डीएनए बाध्य मोती reclaiming और मोती 400 μl 1x टीबी के साथ दो बार धोने से गैर ligated बनती अंत एडेप्टर निकालें.
- 200 μl 1x NTB, 200 μl और फिर 50 μl 1x 2 NEBuffer के द्वारा पीछा के साथ मोती धो लें. पिछले धोने के बाद, 50 μl 1x 2 NEBuffer में मोती resuspend और एक नया ट्यूब को हस्तांतरण.
- अनुक्रमण के लिए पर्याप्त पीसीआर उत्पाद उत्पन्न करने के लिए आवश्यक चक्रों की संख्या का निर्धारण करने के लिए, 6, 9, 12, या 15 के चक्र के साथ चार परीक्षण पीसीआर प्रतिक्रियाओं सेट. (पीसीआर प्रवर्धन की जानकारी के लिए, कृपया देखें: 12 - एक 5% polyacrylamide जेल और Sybr ग्रीन के साथ धुंधला हो जाना पीसीआर प्रतिक्रियाओं पर चल रहे हैं, नकली बैंड और 400 के बीच एक धब्बा की उपस्थिति के अभाव सुनिश्चित करने के द्वारा इष्टतम चक्र संख्या निर्धारित है. 600 आधार जोड़े, जो एडाप्टर के लिए ligation के बाद sheared उत्पादों की लंबाई है.
- हाय-C-पुस्तकालय बाध्य पीसीआर चक्र का इष्टतम संख्या के साथ एक बड़े पैमाने पर पीसीआर में streptavidin मोती के बाकी बढ़ाना. अलग - अलग कुओं से पीसीआर उत्पादों पूल और मोतियों को पुनः प्राप्त. बड़े पैमाने पर पीसीआर उत्पाद का 1% के एक जेल पर चलाने के लिए और 1.8x मात्रा Ampure मोती निर्माता की सिफारिशों के अनुसार के साथ पीसीआर उत्पाद के शेष शुद्ध अलग रखें.
- 50 μl 1x TLE बफर के साथ डीएनए Elute और एक 5% polyacrylamide जेल पर मूल पीसीआर उत्पाद की 1% विभाज्य Ampure मनका शुद्ध पीसीआर उत्पाद का 1% की तुलना, पीसीआर प्राइमरों के सफल हटाने सुनिश्चित करने.
- हम भी क्लोनिंग हाय - सी पुस्तकालय की एक μl और के बारे में 100 सेंगर अनुक्रमण का उपयोग कर क्लोनों की उत्पाद का निर्धारण करने की सिफारिश. यह आपको हाय - सी पीसीआर मिश्रण में पढ़ता alignable के सापेक्ष संख्या का आकलन करने के लिए सक्षम हो जाएगा. विशिष्ट परिणामों के लिए, चित्रा 3B देखें.
- अनुक्रम Illumina बनती अंत अनुक्रमण के साथ पुस्तकालय हाय-C. प्रत्येक स्वतंत्र MAQ (http://maq.sourceforge.net/) का उपयोग कर बातचीत chromatin टुकड़े की पहचान के अंत में संरेखित करें.
चतुर्थ. प्रतिनिधि हाय - सी परिणाम
- निम्न परिणाम जब प्रोटोकॉल हाय - सी तकनीकी अच्छी तरह से मार डाला है और माना जा सकता है गुणवत्ता नियंत्रण के मानकों की उम्मीद कर रहे हैं.
- गुणवत्ता नियंत्रण के कदम को प्रकट करना चाहिए कि दोनों 3C और हाय - सी पुस्तकालयों के रूप में नहीं बल्कि तंग बैंड 10 केबी से अधिक चलाने. एक डीएनए स्मियर गरीब ligation दक्षता इंगित करता है. आमतौर पर, ligation दक्षता थोड़ा हाय - सी एक पुस्तकालय में कम के रूप में एक 3C टेम्पलेट (चित्रा 2A देखें) की तुलना में है.
- हाय - सी अंकन और ligation दक्षता 3C प्राइमरों का उपयोग करते हुए उत्पन्न एक पीसीआर उत्पाद के पाचन से अनुमान लगाया जा सकता है. 3C जंक्शनों HindIII NheI द्वारा काट रहे हैं और नहीं. रिवर्स जंक्शनों हाय सी के लिए सच है. इस पीसीआर पचाने में परख से पता चलता है कि NheI द्वारा और नहीं HindIII द्वारा हाय - सी amplicons का 70% काट रहे हैं, ligation जंक्शनों के कुशल अंकन (चित्रा 2B देखें) की पुष्टि.
- अनुक्रम पढ़ता का विश्लेषण दिखाना चाहिए कि दोनों intrachromosomal और interchromosomal बातचीत, नीले और लाल लाइनों द्वारा इंगित से पढ़ता है, काफी HindIII प्रतिबंध साइटों के लिए करीब है के रूप में बेतरतीब ढंग से उत्पन्न तुलना संरेखित पढ़ता है, हरे रंग में दिखाया गया है (चित्रा 3A देखें).
- एक सफल प्रयोग में alignable पढ़ा जोड़े के 55% interchromosomal बातचीत का प्रतिनिधित्व करते हैं. पंद्रह प्रतिशत कम से कम 20 केबी अलग टुकड़ों और 30% के बीच intrachromosomal बातचीत का प्रतिनिधित्व करते हैं intrachromosomal जोड़े पढ़ा है कि अधिक से अधिक 20 केबी के अलावा (3B चित्रा देखें) कर रहे हैं. इस वितरण में उच्च throughput अनुक्रमण के लिए पहले जांचा जा सकता है, गुणवत्ता नियंत्रण के एक फार्म के रूप में, के बारे में 100 क्लोन क्लोनिंग और सेंगर अनुक्रमण आमतौर पर पर्याप्त है.
- chromatin बातचीत हीटमैप, जहाँ x और y-अक्षों जीनोमिक क्रम में loci प्रतिनिधित्व करते हैं और प्रत्येक पिक्सेल उन दोनों के बीच मनाया बातचीत की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है के रूप में visualized किया जा सकता है. आमतौर पर, डीएनए टुकड़े कि बहुत रैखिक जीनोम में एक दूसरे के करीब प्रवृत्ति अक्सर एक दूसरे के साथ बातचीत करने के लिए होगा. यह एक प्रमुख विकर्ण रूप intrachromosomal heatmaps (4A चित्रा देखें) में देखा जाता है.
- निम्न परिणाम डेटा का विश्लेषण करने के लिए जीनोम संगठन के विभिन्न स्तरों को प्रकट करने के विभिन्न तरीके दिखाने. संपर्क probabilit साजिश रचनेy बनाम जीनोमिक दूरी (चित्रा 5A देखें) से पता चलता है संपर्क की है कि संभावना जीनोमिक दूरी के एक समारोह के रूप में कम हो जाती है, अंततः एक पठार तक पहुँचने है. हर दूरी पर intrachromosomal बातचीत, ठोस लाइन में दिखाया गया है, interchromosomal बातचीत के सापेक्ष समृद्ध है, धराशायी लाइनों द्वारा प्रतिनिधित्व. यह सीधे गुणसूत्र प्रदेशों की उपस्थिति का अर्थ है.
- गुणसूत्रों के सभी जोड़े के बीच interchromosomal संपर्क का मनाया / उम्मीद की संख्या की गणना विशेष गुणसूत्र जोड़े के बीच तरजीही सहयोग से पता चलता है. लघु जीन युक्त गुणसूत्रों preferentially एक दूसरे के साथ बातचीत, चमकीले लाल रंग (चित्रा 5B देखें) ने संकेत दिया है.
- व्यक्तिगत क्रोमोसोम भी जांच की जा सकती है. कच्चे हीटमैप loci के जोड़े के बीच जीनोमिक दूरी के लिए खाते में एक उम्मीद हीटमैप, एक मनाया / उम्मीद हीटमैप में जिसके परिणामस्वरूप के लिए समायोजित किया जा सकता है है. फिर, एक सहसंबंध मैट्रिक्स मनाया / उम्मीद heatmaps की पंक्तियों और स्तंभों correlating द्वारा उत्पादित किया जा सकता है है. सहसंबंध विश्लेषण का उपयोग करना, यह प्रदर्शन किया है कि दो डिब्बों में मानव जीनोम segregates. यह सहसंबंध heatmaps में प्लेड पैटर्न (4A - डी चित्रा देखें) के द्वारा सचित्र है. (हाय - सी डेटा विश्लेषण के विवरण के लिए, कृपया देखें: 1.
- हाय - सी डेटा का प्रयोग, chromatin तह में megabase बड़े पैमाने पर नए अंतर्दृष्टि प्राप्त थे. बहुलक संक्षेपण के शास्त्रीय मॉडल पता चलता है कि एक संतुलन छोटा गोला में chromatin पैक. दूरी के एक समारोह के रूप में की साजिश रचने संपर्क संभावना जीनोमिक दूरी जिसका ढलान लगभग -1 (6A चित्रा देखें) के साथ एक बिजली कानून के रूप में है कि संपर्क प्रायिकता तराजू दिखाता है. यह एक संतुलन छोटा गोला के व्यवहार के साथ संगत नहीं है, लेकिन एक वैकल्पिक एक भग्न छोटा गोला (चित्र 6B देखें) के रूप में जाना जाता संरचना के लिए मैच उम्मीदों करता है.
- यहाँ, दो गोलाकार संरचनाओं दिखाए जाते हैं. रंगाई एक endpoint से दूरी के लिए मेल खाती है, नीले रंग से सियान, हरे, पीले, नारंगी, और लाल (चित्रा 6C शीर्ष देखें) को लेकर है. संतुलन ग्लोबुलेस के विपरीत, भग्न ग्लोबुलेस entanglements की कमी है. एक भग्न छोटा गोला में loci कि समोच्च साथ पास कर रहे हैं 3 डी में पास हो, रंग का ब्लॉकों की उपस्थिति के लिए अग्रणी (चित्रा 6C मध्य देखें) करते हैं. इस तरह के ब्लॉक संतुलन छोटा गोला (चित्रा 6C नीचे देखें) में नहीं पाए जाते हैं.
चित्रा 1 हाय - सी सिंहावलोकन. कोशिकाओं रहे हैं formaldehyde के साथ पार से जुड़े spatially आसन्न chromatin क्षेत्रों (डीएनए टुकड़े: गहरे नीले, लाल, प्रोटीन, जो ऐसे बातचीत की मध्यस्थता कर सकते हैं हल्के नीले और सियान में दिखाया) के बीच सहसंयोजक संबंध में जिसके परिणामस्वरूप. Chromatin प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचा है (यहाँ, HindIII; प्रतिबंध साइट: धराशायी लाइन, इनसेट देखें). परिणामस्वरूप चिपचिपा समाप्त होता है में nucleotides, (बैंगनी डॉट) जिनमें से एक biotinylated है के साथ भर रहे हैं. Ligation बेहद पतला intramolecular ligation घटनाओं पक्ष की शर्तों के तहत किया जाता है, HindIII साइट खो दिया है और एक NheI साइट बनाई गई है (इनसेट). डीएनए शुद्ध है और sheared, और biotinylated जंक्शनों streptavidin मोती का उपयोग कर अलग कर रहे हैं. इंटरेक्ट टुकड़े बनती अंत अनुक्रमण द्वारा पहचाने जाते हैं.
चित्रा 2 हाय-C लाइब्रेरी गुणवत्ता नियंत्रण. (ए) एक 3C नियंत्रण और हाय - सी एक पुस्तकालय की बढ़ती मात्रा में 0.8% agarose जेल पर सुलझाया गया. दोनों पुस्तकालयों 10 केबी की तुलना में एक नहीं बल्कि तंग बड़े बैंड के रूप में चलाते हैं. एक पुस्तकालय में हाय - सी विशिष्ट ligation दक्षता थोड़ा की तुलना में क्या एक 3C टेम्पलेट में मनाया जाता है कम है, और हाय - सी गलियों में धब्बा ने संकेत दिया है. (बी) पीसीआर पचाने में नियंत्रण. एक ligation के दो पास टुकड़ों द्वारा गठित जंक्शन मानक 3C पीसीआर स्थितियों का उपयोग करने के लिए परिलक्षित होता है. हाय - सी ligation उत्पादों ligation साइट के पाचन द्वारा पारंपरिक 3C में उत्पादित उन लोगों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. हाय - सी जंक्शनों, HindIII नहीं NheI द्वारा काट रहे हैं, रिवर्स 3C जंक्शनों के लिए सच है. हाय - सी amplicons के 70% NheI द्वारा काट रहे थे, कुशल पुष्टि ligation जंक्शन के अंकन. दो प्रतिकृति विश्वसनीय मात्रा का ठहराव सुनिश्चित करने के लिए प्रदर्शन किया गया.
चित्रा 3. हाय - सी गुणवत्ता नियंत्रण को पढें . (ए) के लिए इसी टुकड़े से दोनों intrachromosomal (नीला) और interchromosomal बातचीत (लाल) के रूप में काफी HindIII प्रतिबंध साइटों के लिए करीब के रूप में बेतरतीब ढंग से उत्पन्न पढ़ता (हरा) की तुलना में संरेखित पुस्तकें. दोनों intrachromosomal पढ़ता है और interchromosomal पढ़ता घटता HindIII साइट के लिए बढ़ता से दूरी के रूप में तेजी से कमी है जब तक ~ 500 बीपी की दूरी पर एक पठार तक पहुँच जाता है. यह अधिकतम टुकड़ा अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया आकार से मेल खाती है है. (बी) आमतौर पर, alignable पढ़ा जोड़े के 55% interchromosomal बातचीत का प्रतिनिधित्व करते हैं. पंद्रह प्रतिशत कम से कम 20 केबी के टुकड़े के बीच intrachromosomal बातचीत का प्रतिनिधित्व करते हैंके अलावा और 30% intrachromosomal पढ़ा जोड़े कि अधिक से अधिक 20 केबी के अलावा हैं. इस वितरण में उच्च throughput अनुक्रमण के लिए पहले जांचा जा सकता है, गुणवत्ता नियंत्रण के एक फार्म के रूप में, के बारे में 100 क्लोन क्लोनिंग और सेंगर अनुक्रमण आमतौर पर पर्याप्त है.
चित्रा 4. सहसंबंध विश्लेषण दर्शाता है कि नाभिक के दो डिब्बों में अलग है . (ए) 14 गुणसूत्र पर intrachromosomal बातचीत करने के लिए इसी हीटमैप. प्रत्येक पिक्सेल एक 1-Mb ठिकाना और दूसरा ठिकाना 1-Mb के बीच सभी बातचीत का प्रतिनिधित्व करता है, तीव्रता पढ़ता की कुल संख्या (सीमा: 0-200 पढ़ता है) से मेल खाती है है. टिक के निशान हर 10 एमबी दिखाई देते हैं. हीटमैप एक तीव्र विकर्ण और बड़े ब्लॉकों में से एक नक्षत्र के रूप में बुनियाद दर्शाती है. (14 क्रोमोजोम acrocentric है, कम हाथ नहीं दिखाया गया है) हाय - सी डेटासेट का उपयोग करने के लिए एक दिया जीनोमिक दूरी पर loci के एक जोड़ी के लिए औसत संपर्क प्रायिकता की गणना, एक उम्मीद मैट्रिक्स (बी) क्या होगा इसी का उत्पादन किया है मनाया अगर वहाँ कोई लंबी दूरी की संरचनाओं थे. इन दो matrices के भागफल एक मनाया / मैट्रिक्स की उम्मीद है (सी) जहां कमी नीले और लाल रंग में संवर्धन [सीमा: 0.2 (नीला) 5 (लाल)] में दिखाया गया है. ब्लॉक पैटर्न और अधिक स्पष्ट हो जाता है. 14 गुणसूत्र साथ loci के हर जोड़ी के intrachromosomal बातचीत प्रोफाइल के बीच सहसंबंध मैट्रिक्स (डी) सहसंबंध [1 -1 (नीला) रेंज (लाल)] दिखाता है. हड़ताली प्लेड पैटर्न गुणसूत्र के भीतर दो डिब्बों की उपस्थिति इंगित करता है.
चित्रा 5 उपस्थिति और गुणसूत्र प्रदेशों के संगठन. (ए) 1 गुणसूत्र पर जीनोमिक दूरी के एक समारोह के रूप में संपर्क की संभावना कम हो जाती है, अंततः 90Mb ~ (नीला) में एक पठार तक पहुँचने. interchromosomal संपर्क के स्तर (काला डैश) गुणसूत्रों के विभिन्न जोड़े के लिए अलग है, एक गुणसूत्र पर loci में सबसे अधिक 10 गुणसूत्र पर loci (हरी डैश) और कम से कम 21 गुणसूत्र पर loci (लाल डैश) के साथ बातचीत करने की संभावना के साथ बातचीत की संभावना है. Interchromosomal बातचीत intrachromosomal बातचीत के सापेक्ष समाप्त हो रहे हैं. (बी) मनाया / गुणसूत्रों के सभी जोड़े के बीच interchromosomal संपर्कों की संख्या की उम्मीद है. लाल संवर्धन इंगित करता है, और नीले रिक्तीकरण इंगित करता है [रेंज: 2 (लाल) 0.5 (नीला)]. लघु जीन युक्त गुणसूत्रों के लिए एक दूसरे के साथ और अधिक बातचीत करते हैं.
6 chromatin की स्थानीय पैकिंग चित्रा. एक भग्न छोटा गोला के व्यवहार के साथ संगत है . (ए) जीनोमिक दूरी के एक समारोह के रूप में संपर्क प्रायिकता, जीनोम (नीला) भर में औसत. एक प्रमुख शक्ति कानून स्केलिंग 500KB और -1.08 की ढलान (फिट सियान में दिखाया) के साथ 7MB (छायांकित क्षेत्र) के बीच देखा जाता है. (बी) (लाल) संतुलन और भग्न ग्लोबुलेस (नीला) के लिए दूरी के एक समारोह के रूप में संपर्क प्रायिकता के लिए सिमुलेशन परिणाम है. एक भग्न छोटा गोला के लिए ढाल के बहुत करीब -1 (सियान) है, हमारे उपन्यास सैद्धांतिक एक भविष्यवाणी की पुष्टि. एक संतुलन छोटा गोला के लिए 2 / -3 ढलान है, जो पहले सैद्धांतिक अपेक्षाओं से मेल खाता है है. भग्न छोटा गोला के लिए ढलान बारीकी से हाय - सी परिणामों में मनाया ढलान जैसा दिखता है, जबकि एक संतुलन छोटा गोला के लिए ढलान हाय - सी डेटा में नहीं देखा है. (सी) ऊपर: एक सामने आया बहुलक श्रृंखला, 4000 monomers लंबा. रंगाई एक endpoint से दूरी से मेल खाती है है, सियान, हरे, पीले, नारंगी, लाल और नीले रंग से लेकर मध्य: हमारे कलाकारों की टुकड़ी से तैयार एक भग्न छोटा गोला के विशिष्ट उदाहरण है. भग्न ग्लोबुलेस entanglements की कमी है. एक संतुलन छोटा गोला: loci कि समोच्च साथ पास कर रहे हैं करने के लिए 3 डी में पास हो सकता है, बड़ी रंग का ब्लॉकों है कि सतह पर और पार अनुभाग नीचे में स्पष्ट कर रहे हैं की उपस्थिति के लिए अग्रणी हैं. संरचना अत्यधिक उलझा है, loci कि समोच्च (समान रंग) के साथ पास कर रहे हैं 3 डी में पास होने की जरूरत नहीं है.
Discussion
हम एक निष्पक्ष, जीनोम चौड़ा तरीके में chromatin बातचीत मानचित्रण द्वारा 3 आयामी जीनोम की वास्तुकला का अध्ययन करने की एक विधि प्रस्तुत करते हैं. सबसे महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक कदम क्या इस तकनीक के पिछले काम से अलग सेट - कुंद अंत ligation पहले Crosslinked टुकड़े के सिरों प्रतिबंध पर biotinylated nucleotides के समावेश है. इस कदम प्रदर्शन सफलतापूर्वक सभी ligation जंक्शनों की गहरी अनुक्रमण सक्षम बनाता है, और हाय-C अपने दायरे और शक्ति देता है.
पढ़ता संख्या अंततः बातचीत नक्शे के संकल्प का निर्धारण करेगा. यहाँ, मानव जीनोम के लिए एक 1 एमबी बातचीत नक्शा ~ 30 मिलियन alignable पढ़ता का उपयोग करने के लिए प्रस्तुत किया है. आदेश n का एक कारक द्वारा 'सभी उद्देश्य' के संकल्प को बढ़ाने के लिए, पढ़ता की संख्या 2 n के एक पहलू द्वारा वृद्धि की जानी चाहिए.
हाय - सी तकनीक पुस्तकालय पीढ़ी के बाद संकर कब्जा (करने के लिए जीनोम के विशिष्ट भागों लक्ष्य) और chromatin immunoprecipitation ligation के बाद (के लिए विशिष्ट प्रोटीन के साथ जुड़े क्षेत्रों की chromatin वातावरण की जांच) जैसे अन्य तकनीकों के साथ आसानी से जोड़ा जा सकता है है.
Disclosures
हाय - सी विधि (61/100 सिफारिश क्रमांक 151) पर एक अनंतिम पेटेंट समीक्षा के अंतर्गत है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease inhibitors | Sigma-Aldrich | P8340-5ml | Step 1.2 |
| biotin-14-dCTP | Invitrogen | 19518-018 | Step 1.6 |
| Klenow | New England Biolabs | M0210 | Steps 1.6 and 2.2 |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224 | Step 1.9 |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203 | Steps 1.17 and 2.2 |
| 10x ligation buffer | New England Biolabs | B0202 | Steps 2.2 and 3.4 |
| T4 PNK | New England Biolabs | M0201 | Step 2.2 |
| Klenow (exo-) | New England Biolabs | M0212 | Step 2.3 |
| Dynabeads MyOne Streptavin C1 Beads | Invitrogen | 650.01 | Step 3.2 |
| T4 DNA ligase HC | Enzymatics | L603-HC-L | Step 3.5 |
| Phusion HF mastermix | New England Biolabs | F531 | Step 3.8 |
| Ampure beads | Beckman Coulter Inc. | A2915 | Step 3.9 |
References
- Lieberman-Aiden, E., Van Berkum, N. L., Williams, L., Imakaev, M., Ragoczy, T., Telling, A., Amit, I., Lajoie, B. R., Sabo, P. J., Dorschner, M. O., Sandstrom, R., Bernstein, B., Bender, M. A., Groudine, M., Gnirke, A., Stamatoyannopoulos, J., Mirny, L. A., Lander, E. S., Dekker, J. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
- Kosak, S. T., Groudine, M. Form follows function: the genomic organization of cellular differentiation. Genes and Dev. 18, 1371-1384 (2004).
- Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (2007).
- Dekker, J. Gene Regulation in the Third Dimension. Science. 319, 1793-1794 (2008).
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nat Rev Genet. 2, 292-301 (2001).
- Sexton, T., Schober, H., Fraser, P., Gasser, S. M. Gene regulation through nuclear organization. Nat Struct and Mol Biol. 14, 1049-1055 (2007).
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295, 1306-1311 (2002).
- Zhao, Z., Tavoosidana, G., Sjölinder, M., Göndör, A., Mariano, P., Wang, S., Kanduri, C., Lezcano, M., Sandhu, K. S., Singh, U., Pant, V., Tiwari, V., Kurukuti, S., Ohlsson, R. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nat Genet. 38, 1341-1347 (2006).
- Simonis, M., Klous, P., Splinter, E., Moshkin, Y., Willemsen, R., de Wit, E., van Steensel, B., de Laat, W. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nat Genet. 38, 1348-1354 (2006).
- Dostie, J., Richmond, T. A., Arnaout, R. A., Selzer, R. R., Lee, W. L., Honan, T. A., Rubio, E. D., Krumm, A., Lamb, J., Nusbaum, C., Green, R. D., Dekker, J. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): A massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements. Genome Res. 16, 1299-1309 (2006).
- Miele, A., Dekker, J. Mapping Cis- and Trans Chromatin Interaction Networks Using Chromosome Conformation Capture (3C). Methods Mol Biol. 464, 105-121 (2009).
- Maccallum, I., Przybylski, D., Gnerre, S., Burton, J., Shlyakhter, I., Gnirke, A., Malek, J., McKernan, K., Ranade, S., Shea, T. P., Williams, L., Young, S., Nusbaum, C., Jaffe, D. B. ALLPATHS 2: small genomes assembled accurately and with high continuity from short paired reads. Genome Biol . 10, R103-R103 (2009).
