Summary
SNAP-теги и CLIP-теги системах белка маркировки позволяют конкретные, ковалентного присоединения молекул, в том числе флуоресцентные краски, белок в живых клетках. После клонирован и выражен, помеченный белок может использоваться с различными субстратами для многочисленных приложений вниз по течению, не имея для клонирования снова.
Abstract
SNAP-теги и CLIP-теги системах белка маркировки позволяют конкретные, ковалентного присоединения молекул, в том числе флуоресцентные краски, белок в живых клетках. Эти системы предлагают широкий выбор флуоресцентных субстратов оптимизированы для диапазона изображения приборов. После клонирован и выражен, помеченный белок может использоваться с различными субстратами для многочисленных приложений вниз по течению, не имея для клонирования снова. Существуют два шага, чтобы с помощью этой системы: клонирование и экспрессия белка интерес как SNAP-теги фьюжн, и маркировка слияния с SNAP-теги субстрат выбора. SNAP-тег небольшой белок, основанные на человеческих O
Protocol
Покрытие CHO-K1 клеток:
- Добавить 100 мкл 50-СНО-К1 клетки, которые были трипсином в соответствии со стандартными протоколами к 6 мл полной F-12K.
- Смешайте клеточной суспензии с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз, затем аликвоту 300 мкл суспензии клеток трипсином в каждую лунку стерильного 8-камера Lab-Tek II патрон покровного стекла с № 1,5 боросиликатного покровного стекла камеры (Nalgene Nunc Int;. Продукт # 155409; Лот: 100808-8-0).
- Инкубируйте образцы при температуре 37 ° C, 5% СО 2 за одну ночь.
Переходные Трансфекция CHO-K1 Клетки с pSNAP-ADRB2 и pSNAP-H2B:
- Проверьте клеточной культуры посеяны камер в предыдущий день, чтобы искать плотность клеток и здоровья.
- Этикетка соответствующее количество микроцентрифужную труб.
- В ламинарном боксе, созданный трансфекции сложных смесей в соответствии со следующей таблицей образца, используя или 0,3 мкг pSNAP-ADBR2 управления плазмидной ДНК или 0,3 мкг pSNAP-H2B управления плазмидной ДНК, 1 мкл TransPass D2 и 1 мкл TransPass V в реакции.
плазмида число реакций мкл бессывороточной среде мкл TransPass D2 мкл TransPass V мкл ДНК плазмиды мкл TransPass D2/reaction мкл TransPass В / реакции нг ДНК / реакции ДНК конц. (Нг / мкл) мкл ДНК плазмиды / реакции SNAP-ADRb2 5 236,5 5 5 3,5 1 1 300 472,34 0,7 H2B-SNAP 5 237 5 5 3 1 1 300 515,89 0,6 Макет 5 240 5 5 0 1 1 0 0 0 Untransfected 5 250 0 0 0 0 0 0 0 0 - Во-первых, смесь сыворотки F-12K с соответствующим плазмидной ДНК, а затем добавить TransPass D2 реагентов трансфекции, а затем добавить Трансфекция TransPass V реагентов. Смешайте компоненты и с помощью пипетки вверх и вниз, мягко несколько раз после добавления каждого реактива.
- Инкубируйте реакции при комнатной температуре в течение 30 минут.
- Во время инкубации, мыть клетки один раз с 600 мкл полной DMEM и добавить 450 мкл полной DMEM к каждому образцу.
- Добавить 50 мкл трансфекции сложную смесь для каждого образца, медленно и по каплям моды.
- Инкубируйте образцы ночи при 37 ° C, 5% СО 2.
SNAP-Cell ПМР Звезда Маркировка СНО-К1 клетки Временно трансфицированных pSNAP-ADRB2 и pSNAP-H2B:
- Осторожно снимите трансфекции комплексом средств массовой информации из каждого образца вакуумного отсоса. Вымойте клетки в два раза с 600 мкл полной F-12K и заменить средства массовой информации в каждую лунку с 600 мкл полной F-12K.
- Смешайте СМИ красителя маркировки, добавив 995 мкл полной F-12K и 51 мкл 0,6 мМ SNAP-Cell TMR-Star подложки. Конечная концентрация SNAP-Cell TMR-звезда должна быть 3 мм. Внесите вверх и вниз несколько раз, чтобы смесь после добавления субстрата.
- Осторожно снимите питательной среды из образцов и добавить 200 мкл красителя СМИ маркировки в каждую лунку. Инкубируйте образцы при температуре 37 ° C, 5% СО 2 в течение 30 минут.
- Хотя образцы инкубации, подготовить Hoechst 33342 решением для ядерных окрашивания образцов путем смешивания 1 мкл Hoechst 33342, тригидрохлорид, тригидрат (10 мг / мл раствора в воде, 16,2 мМ раствора; Invitrogen молекулярных проб) в 10 мл полной F-12K .
- Выньте материал из всех образцов и добавить 600 мкл разбавленного раствора Hoechst к каждому образцу. Инкубируйте образцы при температуре 37 ° C, 5% СО 2 в течение 5 минут.
- Вымойте образцы три раза с 600 мкл полной F-12K.
- Инкубируйте образцы при температуре 37 ° C, 5% СО 2 в течение дополнительных 30 минут, чтобы дать неинкорпорированных флуорофора диффундировать из клетки.
- Через 30 минут, изменение средств массовой информации на SNAP-Cell образцы в последний раз и переходите к визуализации.
- Изображение клетки с использованием Zeiss Apotome Axiovert 200M флуоресцентного микроскопа.
Представитель Результаты
Рисунок 1. Вотнекоторые показательные результаты флуоресцентной визуализации с использованием стандартных флуоресцентной микроскопии живых COS-7 клетки, которые выражают SNAP-теги слияний. Это первое изображение показывает жить COS-7 клетках, экспрессирующих pSNAP-H2B (ядерных гистонов) помечены SNAP-Cell TMR-Star. PSNAP-H2B построить, создан с помощью pSNAP-теги (м) вектор. Клетки были помечены SNAP-Cell TMR-Star в течение 30 минут и контрастно с Hoechst 33342 (синий) для ядер. Розовый флуоресценции демонстрирует наложение красной флуоресценции гистонов, где белок присутствует в дополнение к синей флуоресценции указывает ядру. Экспрессии белка H2B четко и легко определить.
На рисунках 2 и 3. Следующие две картинки показывают жить COS-7 клетки временно трансфицированных pSNAP-ADRβ2.
Клетки были помечены SNAP-Cell TMR-Star (красный) и контрастно с Hoechst 33342 (синий). PSNAP-ADRβ2 построить, создан с помощью pSNAP-теги (м) вектор. Клетки были помечены SNAP-Cell TMR-Star в течение 30 минут и контрастно с Hoechst 33342 (синий) для ядер. Красной флуоресценции указывает на присутствие на поверхности клеток ADRB2 рецепторного белка в то время как синяя флуоресценция идентифицирует ядро.
Discussion
Есть несколько факторов, влияющих на результаты наблюдений, таких как фокус, интенсивность лазерного излучения, оборудование возможностей, используемого объектива и т.д. фотостабильность флуорофора определяет, насколько быстро флуоресценции должно быть захвачен был утрачен.
Такой способ маркировки белка является универсальным и подходит для многих приложений. SNAP-теги и CLIP-теги технологий для конкретной маркировки белков слияния с синтетическими зондов позволяют различным аспектам функции белка, в том числе различные динамические процессы в живых клетках и в клеточных лизатов. SNAP-, CLIP-, MCP-и ACP-теги технологии обеспечивают простоту и чрезвычайных универсальность визуализации белков в живых и фиксированных клеток и изучение белков в лабораторных условиях. Создание единого построить ген дает меткой гибридный белок способен образовывать ковалентную связь с различными функциональными группами, в том числе флуорофоров, биотин, или бусы. Белок должен быть клонированы и выразил только один раз и затем синтез можно использовать с различными флуоресцентными субстраты для многочисленных вниз по течению приложений, таких как одновременная маркировка белка внутри живых клеток, локализация белка и транслокации, широтно-погони эксперименты, исследования рецепторов интернализации , селективный маркировки поверхности клеток, белка выпадающем анализы, белок обнаружения в SDS-PAGE, проточной цитометрии, высокой пропускной обязательные анализы в микротитровальных пластин, биосенсор экспериментов взаимодействия, и FRET основе обязательных анализов.
Disclosures
Авторы являются сотрудниками Новой Англии Биолабс, который производит реактивы и инструменты, используемые в этой статье.
Acknowledgments
Кай Джонсон
Иван Корреа
Андреас Брехта
Катрин Müentener
Крис Noren
Ло ВС
Сюй Мин
Теодор Дэвис
Сальваторе Russello
Aihua Чжан
Инков Гош
Элисса Maunus
Николай Лабарт
Джеймс Макфарленд
Джон Басуэлл
Бренда Десмонд
Джеймс Эллард
Дон Comb
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-K1 Cells | ATCC | CCL-61 | |
| Serum free F-12K | |||
| Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers | Nalge Nunc international | 155409 | Lot: 100808-8-0 |
| DMEM | |||
| H–chst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution) | Invitrogen | H3570 | 470519 |
| Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Transpass V | New England Biolabs | M2561S | 0030709 |
| Transpass D2 | New England Biolabs | M2554S | 0060802 |
| SNAP-Cell TMR Star | New England Biolabs | S9105S | 0010811 |
| pSNAP-ADBR2 Control Plasmid | New England Biolabs | N9178S | 0010811 |
| pSNAP-H2B Control Plasmid | New England Biolabs | N9179S | 0010811 |
References
- Johnsson, K. Visualizing biochemical activities in living cells. Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).
- Johnsson, K. SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function. NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).
