Summary
动物帽高表达的基因产物（S）移植到发展中国家的侧翼
Abstract
许多蛋白质在胚胎发育中发挥的双重作用。那些规范在一个特定的组织细胞命运决定的，也可以影响的一个较大区域的胚胎的发展。这使得确定其在一个特定的组织中的作用难以分析。例如，
Protocol
第一部分设置为ACT检测
- 生成皑皑的RNA注射制造商的建议，使用他们的酚：氯仿纯化方法（如mMessage mMachine套件;美国应用生物系统公司/ Ambion公司，奥斯汀，德克萨斯）。 RNA的编码一种荧光蛋白作为示踪。我们抄录或者黄色荧光蛋白（YFP）或mCherry 5基因，这是在pCS2 +表达载体。
- 拉硼硅玻璃毛细管形成锥形玻璃提示，使用微量拉马。我们使用萨特微管牵引器，P - 97（萨特仪器公司，诺瓦托，CA），如前面所述6。
- 表1无菌解决方案，从一个10 X马克的修改林格的疫苗（MMR）解决方案的股票（10 mM的MgCl 2的20 mM的氯化钾; 20 mM 的氯化钙; 50 mM的HEPES; 1中号氯化钠;调整pH值7.5，高压灭菌，并储存在RT）。
- 隔离从一个男性的青蛙睾丸和组织1X MMR /庆大霉素（50微克/毫升硫酸庆大霉素; BioWhittaker，猫＃17 - 518Z）在无菌溶液保存在4 ° C。这可以在实验开始前的一个星期，但它是失去时间的推移其疗效。
- 产蛋的解决方案（1X：2.62 mM的氯化钾，氯化钠150毫米，0.8毫米的Na 2 HPO 4 Trizma基地，20毫米，2.62 毫米碳酸氢钠3，2.75毫米硫酸镁;调整pH至7.6），可作为8X股票，这可以保存在4 ° C为两个星期。 注意 ：要注意在这一解决方案的污染，因为这会影响鸡蛋的质量。
- 生成注入板块。要做到这一点，在0.4X在微波炉MMR中熔化1％琼脂糖，加入到60毫米板〜6毫升熔化的琼脂糖溶液，轻轻解开一个弹性模具上顶级的解决方案，以防止泡沫，让凉爽约（图1）在室温下20分钟。要确定所需的数量，考虑实验条件（ 例如：1，YFP的; 2，YFP + Noggin）和需要移植的主机胚胎数量。对于我们的实验中，我们为每个实验条件下产生至少20移植的主机胚胎。在18-19℃，胚胎将在阶段15，约一个小时。如果需要一小时进行20次移植，则需要两个施肥时间点，假设主机的胚胎接受的移植。因此，将需要四个注射菜（2 EXP条件× 2施肥时间点= 4）。长达一个星期，保存在4 ° C的板块。
- 生成第隔离板使用1％琼脂糖+ 0.7X MMR疫苗注射板与模具。请注射板加一个额外的每施肥时间点（4 +2施肥时间点= 6）相同数量的上限隔离。
- 注入500个单位绒毛膜促性腺激素显微注射前一天在一天中较晚的女性。商店女性在16-18 ° C过夜。
第二部分。 非洲爪蟾胚胎的RNA显微注射
A.制备用于显微注射
- 取出女性激素诱导它们放置在个人坦克包含1X产蛋解决方案（ELS）注 ：我们不使用已在ELS两个多小时，卵子的质量，减少鸡蛋。因此， 在体外受精前约一个小时，我们放弃从油箱，使所有的鸡蛋只刚产下的蛋收集。
- 准备通过剪断尖获得直径为25-35微米的显微注射针。广场上picoinjector针和校准，使分配每次注射10 NL。
- 设置一个孵化至14 ° C。
- 一旦女性奠定了约一个小时，使用移液管从水箱取出鸡蛋和60毫米培养皿放入鸡蛋。鸡蛋尽可能多的ELS删除和替换1X的MMR。受精鸡蛋可以马上或在1X的MMR逗留长达一个小时。对于移植实验，这是最好的施肥两个菜，80％的鸡蛋最多的单层三个分批于上午11时左右，中午和下午1时。注射后，它们将被放置在14 ° C，使他们成长到第隔离（阶段8.5-9）和器官移植所需的阶段（第一阶段15;见我，＃6段）部分。
- 要检查睾丸的质量，我们执行一个清晨施肥（上午8时），它允许我们提取从另一个男性的睾丸，如果从第一个精子是没有生命力的的。注：我们均质〜0.25睾丸在1 mL 1X孕产妇死亡率和增加约5至7％的卵母细胞板滴。
- 匀浆睾丸在体外授精的鸡蛋，一个小时后，使用果冻解决方案上的鸡蛋取出果冻大衣（164μl1M数码地面电视+ 10ml 1M三中，pH值8.8至50毫升蒸压nanopure水） 。等待，直到他们达到两细胞阶段开始排序，这需要约2小时18 ° C或1.5小时，在室温（22℃）。
- 使用一个TRANSF二吸管，排序均匀色素和均匀分裂的胚胎，作为显示在图3中左边的动物帽，到充满0.4X孕产妇死亡率+ 6％聚蔗糖注射菜很好。
B.微量注射
- 长达一个60毫米的培养皿盖顶部的封口膜。吸取2μL上的封口膜和使用PLI - 100来填补你的注射针吸你的第一个RNA样品。一定要检查样品针仍然是配药开始前注射液10 NL。
- 在另一盘7 500 PG YFP的RNA在一盘和您感兴趣的（如20 PG Noggin RNA）的基因加YFP的RNA注入20-30两细胞阶段的胚胎（两个卵裂球）。
- 广场100-200非注射胚胎，每个时间点，在另一个与聚蔗糖溶液注射菜。将它们和孵化器，同时注入的胚胎。这些都是要在第四部分中使用的主机。
- 注射后，所有胚胎孵育14℃过夜。重复所有的时间点。
第三部分。隔离注入胚胎的动物帽
- 清晨抵达阶段的胚胎。最早的时间点应该是第9期。删除那些没有生存。继续执行以下步骤，每个时间点分批工作。
- 从每盘倒掉的聚蔗糖的解决方案，并添加回0.7X MMR /庆大霉素解决方案。一个上限隔离菜，加0.7X MMR /庆大霉素解决方案的慷慨金额。使用移液管和地方在新鲜配制的第隔离菜一个，从他们的注射菜井打跑胚胎。
- 0.7X孕产妇死亡率+庆大霉素溶液中分离的动物帽，保持完整的分期2个或3个胚胎。无论是Gastromaster，安装有一个黄色的提示弯曲至400微米，或一双锐利5钳都可以使用。
- 直到第二天将在14 °彗星孵化器盖。孵化器在为上限的同时，保持在相同的供体组织的发育阶段，他们应该从主机胚胎。
第四部分。移植到侧翼上限
- 从第一个时间点从14℃培养箱取出瓶盖和胚胎阶段的胚胎。统一的黄色或红色荧光阳性的上限，根据示踪剂注入（图2），排序。
- 计数的上限数量，删除双阶段12-13胚胎与0.7X MMR /庆大霉素溶液新鲜配制的注射菜。随着尖锐的＃5钳，删除每个卵黄膜。他们转移到该板块的上限，但要小心。如果没有他们的卵黄膜，胚胎可以快速解离水面。
- 使用gastromaster（黄尖，200 - 250微米的弯曲线，最高设置）或＃5镊子，取出一个200微米见方一侧的胚胎阶段14日至15日（图3）。然后，削减了一半的上限（与gastromaster或＃5镊子）和地方组织在主机中的胚胎中取得的孔。旋转以及对胚胎允许愈合。许多胚胎，你可以做，而他们在舞台15。重复所有的时间点。
- 胚胎通常会在30分钟内愈合。删除的死细胞（白）＃5镊子轻柔的刷牙议案。养在18 ° C过夜。
- 荧光显微镜下解剖，荧光标记，移植组织的排序胚胎。把它们早在18 ° C至成长，直到42-43阶段。
- 在tricaine麻醉动物。在这一点上，你可以采取的荧光解剖显微镜下的图片。完成之后，修复，部分使用标记为您感兴趣的组织在原位杂交和免疫染色或执行。
图1。有机玻璃设计铸造橡胶模具，用于胚胎控股菜。一个38 x 38毫米圆角方形（〜5毫米深）已经排到了一块50 × 50平方毫米和25毫米厚的有机玻璃。圆形，均匀分布的井直径（1.5毫米）已钻深1毫米到塑料。为了使弹性体的显微注射菜模具，倒入有机玻璃Sylgard弹性，使得它能够巩固，按制造商的说明。这弹性模是用来注射和第隔离板。
图2。排序前移植的动物帽是重要的，因为表达可以有所不同 。动物在左边的第表示mCherry整个组织均匀，而右边的外植体参差不齐的表达，都将被丢弃。
图3。主机tadpOLE开发了一个眼状结构，其侧翼从移植的动物第细胞。一种荧光图像已明的形象重叠。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这段视频中，我们已经证明我们的爪生物学家使用的经典技术，我们重新安排，以建立动物帽移植的实验版本。在室温条件下， 爪蟾胚胎发育非常迅速地通过9级和15级。通过放置在14℃，胚胎发育减慢，并可以在一个实验中进行更多的移植。如果有必要将增长到老年阶段（42/43）的胚胎，那么我们建议，利用转基因金星YFP的动物，因为年纪较大的蝌蚪注入荧光蛋白在信号衰。我们用这个实验，建立动物第组织表达EFTFs或Noggin被指定为形成眼状组织。此法可以用来作为一个简单的测试，以确定是否一个感兴趣的基因（S）确定一个特定的细胞的命运是必要的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
这项工作得到了从研究经费，以防止失明（职业发展奖MEZ和ASV和不受限制授予眼科部），大肠杆菌明德Zeigler基金会（MEZ和ASV）和美国国家眼科研究所/美国国立卫生研究院（MEZ ，补助金R01EY015748和R01EY017964）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Applied Biosystems | AM1340 | |
| Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) | FHC, Inc. | 27-30-1 | |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | BW17-528Z | |
| Sylgard/elastomer Kit 1.1lb | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0160 | |
| human chorionic gonadotropin | Intervet Inc. | 22219 | |
| Pico-Injector Microinjection Systems | Harvard Apparatus | 650003 | |
| Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator | Fisher Scientific | 11-680-21 | |
| Transfer pipette | Krackeler Scientific, Inc. | 6290-20635A | |
| Dumostar #5 Forceps | Fisher Scientific | 11295-10 |
References
- Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
- Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. , Humana Press. Towata, N.J. (1999).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. , (2008).
- Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2009).
