Neuroscience

Subventricular क्षेत्र एन चेहरा: Wholemount धुंधला और Ependymal फ्लो

Published: May 6, 2010 doi: 10.3791/1938

Zaman Mirzadeh¹, Fiona Doetsch^2,3, Kazunobu Sawamoto⁴, Hynek Wichterle^2,5, Arturo Alvarez-Buylla¹

¹Department of Neurosurgery, The Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California, San Francisco - UCSF, ²Department of Pathology and Cell Biology, College of Physicians and Surgeons, Columbia University, ³Department of Neuroscience and Neurology, College of Physicians and Surgeons, Columbia University, ⁴Department of Developmental and Regenerative Biology, Nagoya City University Graduate School of Medical Sciences, ⁵Center for Motor Neuron Biology and Disease, College of Physicians and Surgeons, Columbia University

Summary

पार्श्व वेंट्रिकल की दीवारों वयस्क स्तनधारी दिमाग में सबसे बड़ा क्षेत्र कीटाणु होते हैं. परंपरागत रूप से, इस क्षेत्र में neurogenesis पर अध्ययन histological विश्लेषण के लिए शास्त्रीय सेक्शनिंग तकनीकों पर भरोसा है. यहाँ हम एक वैकल्पिक दृष्टिकोण, wholemount तकनीक है, जो एक व्यापक, इस कीटाणु क्षेत्र के दृश्य एन चेहरा प्रदान करता है वर्तमान.

Abstract

पार्श्व ventricles की दीवारों वयस्क स्तनधारी दिमाग में सबसे बड़ा क्षेत्र कीटाणु होते हैं. इन दीवारों में subventricular क्षेत्र (SVZ) एक बड़े पैमाने पर अध्ययन तंत्रिका स्टेम सेल के व्यवहार और वयस्क neurogenesis के विनियमन को समझने के लिए मॉडल प्रणाली है. परंपरागत रूप से, इन अध्ययनों histological विश्लेषण के लिए शास्त्रीय सेक्शनिंग तकनीकों पर भरोसा है. यहाँ हम एक वैकल्पिक दृष्टिकोण, wholemount तकनीक है, जो एक व्यापक, इस कीटाणु क्षेत्र के दृश्य एन चेहरा प्रदान करता है वर्तमान. वर्गों की तुलना में wholemounts SVZ के भीतर पूरा cytoarchitecture और सेलुलर संबंधों की रक्षा. यह दृष्टिकोण हाल ही में पता चला है कि वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं, या प्रकार बी 1 कोशिकाओं, विभेदित ependymal पार्श्व ventricles अस्तर कोशिकाओं के साथ एक मिश्रित neuroepithelium का हिस्सा हैं. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण ependymal कोशिकाओं और मस्तिष्कमेरु द्रव प्रवाह वे वेंट्रिकल में उत्पन्न planar ध्रुवीकरण का अध्ययन किया गया है. हाल ही में सबूत है कि वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल कि क्षेत्रीय निर्दिष्ट किया जाता है एक विषम जनसंख्या के साथ, wholemount दृष्टिकोण की संभावना और इस स्टेम सेल आला के संगठन parcellation समझने के लिए एक अनिवार्य उपकरण हो जाएगा.

Protocol

मैं Ependymal फ्लो परख के लिए प्रतिदीप्त microbeads (इन चरणों अगर धुंधला प्रयोजनों के लिए wholemounts केवल तैयारी छोड़ी नहीं जा सकती है) के साथ भरा ग्लास micropipettes तैयार करना.

कांच micropipette डांड़ी पर एक Wiretrol 5 उल गिलास केशिका ट्यूब सुरक्षित और हीटर और solenoid सेटिंग्स समायोजित करने के लिए एक चिकनी, उथले शंकु के साथ विंदुक खींच.
संलग्न खींच micropipette के अंत पर सकारात्मक हवा के दबाव का एक स्रोत और एक धातु की झंझरी सतह पर धीरे कम पिपेट की एक 45 ° कोण पर टिप एक beveled टिप बनाने के लिए. सकारात्मक हवा के दबाव विंदुक के अंदर से कांच मलबे को साफ करने में मदद करता है. एक इथेनॉल सिक्त ऊतक के साथ beveled टिप के अंत साफ करो.
एक micrometer के साथ एक खुर्दबीन के नीचे पिपेट की नोक जांच करते हैं. टिप ~ 100 उम की एक आंतरिक व्यास खोलने के साथ एक चिकनी बेवल होना चाहिए. छोटे व्यास लेकिन इस्तेमाल किया जा सकता है अक्सर मोतियों के साथ फ्लोरोसेंट विंदुक के clogging में परिणाम.
खनिज तेल के साथ backfill विंदुक जब तक आधा भरा है, तो पिपेट की पीठ में तेल डूबा सवार सम्मिलित है. विंदुक टिप करने के लिए मैन्युअल रूप से सवार में धकेलने के द्वारा अग्रिम खनिज तेल का meniscus.
Micromanipulator पर micropipette और सवार सुरक्षित है, तो समायोज्य ऊंचाई के साथ एक छोटे से स्थिर हाथ पर micromanipulator विंदुक धारक पेंच.
विंदुक Frontload फ्लोरोसेंट microbead समाधान, 50% फ्लोरोसेंट microbead शेयर समाधान, 45% पानी है, और 5% ग्लिसरॉल से मिलकर. ग्लिसरॉल समाधान के घनत्व में वृद्धि इतनी है कि जब wholemount जमा पर microbeads सतह पर सिंक करने के लिए जोड़ा जाता है.
एक सुरक्षित जगह है जहाँ सुई जा गलती नहीं तोड़ा जाएगा और wholemount विच्छेदन के साथ आगे बढ़ना में micromanipulator रखें.

द्वितीय. Wholemount विच्छेदन और फिक्सेशन

Wholemount विच्छेदन के लिए तैयार करने के लिए, गर्म 37 के लिए L-15 लेबोविट्ज़ मीडिया के लिए पर्याप्त मात्रा ° सी. आप लगभग 10 मिलीलीटर की जरूरत जानवर के प्रति आप काटना योजना जाएगा. कैंची, दांतेदार बड़े संदंश, चिकनी ठीक संदंश, Sharpoint 22.5 ° microsurgical चाकू चाकू, विदारक पकवान, कागज तौलिया, biohazard बैग, और बर्फ पर एक 24 अच्छी तरह से थाली के साथ भरा: इसके अलावा आप विच्छेदन और stereomicroscope द्वारा नियतन के लिए की आवश्यकता होगी सभी आपूर्ति इकट्ठा के साथ या बिना Triton एक्स 100 0.1% 4% paraformaldehyde. Triton एक्स 100 पीएफए समाधान है, जो wholemount सतह जब यह इस समाधान में डुबो कर्तन की घटना घट जाती है की सतह तनाव कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
एक विदारक एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope के तहत रखा पकवान में गर्म मीडिया के 5-10 मिलीलीटर डालो. विदारक व्यंजन एक लोचदार बहुलक, 184 Sylgard कहा जाता है, एक 6 सेमी प्लास्टिक पकवान में डालने के लिये और दे वैक्यूम के तहत एक सप्ताह के लिए बहुलक समाधान इलाज द्वारा तैयार कर रहे हैं, तो पानी की बड़ी मात्रा में उपयोग करने से पहले अच्छी तरह से व्यंजन rinsing. आमतौर पर, हम व्यंजन 1 एल बीकर में पानी में 1 सप्ताह के लिए लेना.
जानवर गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से बलिदान और सिर काट रहा है.
नोट: अगर वांछित, रक्त सामान्य नमक के साथ पशु पहले perfusing बाहर मस्तिष्क विदारक vasculature से मंजूरी दे दी हो सकता है. यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है अगर diaminobenzidine (थपका) के साथ chromogenic immunostaining प्रदर्शन.
एक midline चीरा बनाया है, खोपड़ी प्रकट करने के लिए खोपड़ी साथ पूर्वकाल के लिए पीछे.
4 खोपड़ी में कटौती की एक श्रृंखला cranium खोलने के लिए बना रहे हैं: एक कट spans दो कक्षाओं घ्राण बल्ब के लिए पूर्वकाल है, अगले दो कटौती सेरिबैलम के लिए अवर हैं और खोपड़ी आधार से अलग cranium, और अंतिम कट चलाता है मध्य बाण के समान सिवनी साथ पूर्वकाल के लिए पीछे.
कपाल फ्लैप धीरे से मुकर रहे हैं और मस्तिष्क निकाले और विदारक पकवान में रखा गया है.
विच्छेदन के शेष stereomicroscope के तहत किया जाता है. सबसे पहले, घ्राण बल्ब दूर मस्तिष्क से विच्छेदित कर रहे हैं. यदि आप अतिरिक्त इच्छा है कि घ्राण बल्ब की जांच, बस उन्हें विसर्जन द्वारा 4% पीएफए में रात को ठीक है और आप बाद में उन्हें सेक्शनिंग और धुंधला हो जाना करने के लिए तैयार हो सकता है.
Interhemispheric विदर साथ मस्तिष्क फूट डालो.
Coronally उन्मुख कटौती तो पीछे सबसे interhemispheric विदर के पहलू पर बना है, दुम हिप्पोकैम्पस पार अनुभाग में देखे जा अनुमति देता है.
हिप्पोकैम्पस है, जो इस स्थिति में पार्श्व वेंट्रिकल के औसत दर्जे का दीवार रूपों तो overlying प्रांतस्था, जो वेंट्रिकल की दीवार पृष्ठीय पार्श्व रूपों से जारी होना चाहिए. सबसे पहले, चाकू प्रांतस्था और dorsally हिप्पोकैम्पस के बीच छोटे निलय अंतरिक्ष में डाला जाता है, और एक कट प्रांतस्था, जहां यह ventrally दर्शाता है में किया जाता है, midline से दूर करने के लिए हिप्पोकैम्पस में शामिल होने. इस कटौती के बाद किया जाता है, प्रांतस्था धीरे पार्श्व वेंट्रिकल पृष्ठीय से उदर चलती प्रकट हिप्पोकैम्पस से किया जा सकता है दूर खुली है. इस पैंतरेबाज़ी हैबंद कोने जहां हिप्पोकैम्पस जारी किया गया था प्रांतस्था का एक पच्चर काटने से तेजी लाई. इस स्थिति में पार्श्व वेंट्रिकल के सबसे उदर हद तक पहुँचने के बाद, आप या तो कल्पना या लगता है जहां प्रांतस्था फिर आसपास wraps सकता है, इस समय को दर्शाती वापस medially, हिप्पोकैम्पस में शामिल होने. इस स्थिति में एक और कटौती किया जाना चाहिए पूरी तरह से हिप्पोकैम्पस या प्रांतस्था या पार्श्व वेंट्रिकल की पार्श्व दीवार से पार्श्व वेंट्रिकल की औसत दर्जे का दीवार जारी है.
यह तो आसान हो हिप्पोकैम्पस प्रांतस्था से दूर खींच है, medially और पूर्व से, पार्श्व वेंट्रिकल व्यापक रूप से खोल.
धीरे पूर्व से संदंश और चाकू के छोटे स्ट्रोक का उपयोग करने के लिए औसत दर्जे का है और पार्श्व दीवारों के अलावा वापस लेना हिप्पोकैम्पस खींच जारी रखें.
एक बार इस तर्क के लिए प्रतिरोध को बढ़ाने के लिए शुरू होता है, अतिरिक्त कटौती की जरूरत हैं. पहले, अपने पार्श्व वेंट्रिकल के लिए जोखिम को बढ़ाने के लिए और विशेष रूप में, पार्श्व दीवार और SVZ, दूर प्रांतस्था काटना. प्रांतस्था सफाई महासंयोजिका और / VZ SVZ के बीच इंटरफेस visualizing द्वारा दूर dissected. बस इस callosal पक्ष पर रहने SVZ हानिकारक से बचने के इंटरफ़ेस के साथ काटा.
आदेश में औसत दर्जे का दीवार पार्श्व दीवार से दूर retracting जारी रखने के लिए, दो और अधिक कटौती की जरूरत है: एक dorsally कटौती जहां पार्श्व दीवार, औसत दर्जे का दीवार, और प्रांतस्था सब एकाग्र, और एक ventrally कटौती जहां पार्श्व दीवार, औसत दर्जे का, दीवार और thalamus एकाग्र. इन कटौती की है, औसत दर्जे का दीवार पर आगे कोमल त्याग पार्श्व वेंट्रिकल की सबसे पूर्वकाल हद तक खोला जा करने की अनुमति देता है.
समुचित प्रकाश व्यवस्था प्रक्रिया के दौरान और विशेष रूप से जहां पूर्व से औसत दर्जे का है और पार्श्व दीवारों से अलग हो रहे हैं अगले कदम में आवश्यक है. पार्श्व वेंट्रिकल में इस पूर्वकाल स्थिति में, औसत दर्जे का दीवार वापस दर्शाता है और पार्श्व दीवार के साथ सतत है. ऐसी है कि दोनों दीवारों के बीच डाली छाया इस प्रतिबिंब बिंदु है, जो दो दीवारों के बीच एक घाटी की तरह दिखाई देता है प्रकट प्रकाश समायोजित करें. इस घाटी में बिल्कुल कट करने के लिए इन दो दीवारों अलग.
अंत में, पूरी तरह से किसी भी overhanging dorsally प्रांतस्था और thalamus ventrally को हटाने के द्वारा पार्श्व दीवार का पर्दाफाश.
यदि immunostaining के लिए wholemounts तैयार है, ध्यान से wholemount, निलय पक्ष हस्तांतरण, विच्छेदन पकवान से एक 24 अच्छी तरह के साथ या बिना ट्राइटन-X100 0.1% 4% पीएफए के साथ 4 पर एक रात निर्धारण के लिए भरा थाली डिग्री सेल्सियस में निर्धारण के प्रति संवेदनशील प्रतिजनों के लिए, wholemounts समय की एक छोटी अवधि के लिए तय किया जा सकता है. फिर immunostaining wholemounts पर धारा 4 के लिए आगे बढ़ना.
यदि ependymal प्रवाह विश्लेषण के लिए wholemounts की तैयारी, एक साफ विच्छेदन ताजा, 37 डिग्री सेल्सियस लेबोविट्ज़ माध्यम से भरा पकवान wholemount हस्तांतरण और अगले अनुभाग पर जाएँ.

III. Ependymal फ्लो प्रतिदीप्त microbeads का उपयोग विश्लेषण

एक साफ विदारक 2 कीट पिन, और thalamus में wholemount के पूर्वकाल - पृष्ठीय कोने में एक का उपयोग पकवान पर wholemount स्थिर.
स्थिर हाथ पकड़े stereomicroscope करने के लिए अगले micromanipulator के आधार रखें. यकीन है कि समायोज्य बांह की ऊंचाई ज़्यादा से ज़्यादा विच्छेदन पकवान के खिलाफ सुई को तोड़ने से बचने के लिए ऊपर उठाया है.
ध्यान मीडिया में सुई की एक ependorf ट्यूब में टिप डुबकी के लिए रवाना microbeads है कि सुई की बाहरी नोक पर मौजूद हैं साफ. यदि इन दूर साफ नहीं कर रहे हैं, वे बाद में wholemout सतह पर जमा किया जा सकता है अनजाने में सुई स्थिति के दौरान और फिल्म की समग्र गुणवत्ता को कम.
पार्श्व दीवार की पृष्ठीय सतह पर सुई टिप स्थिति और कम हाथ के मध्यम में सुई टिप लाने. सुई जब तक यह सिर्फ पार्श्व दीवार की सतह से ऊपर है कम किया जाना चाहिए.
स्थिति में सुई के साथ, ज़ूम समायोजित और stereomicroscope पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक वांछित क्षेत्र को कवर. यदि आप ependymal प्रवाह के एक रिकॉर्डिंग हो रही होगी, इस समय छवियों को प्राप्त शुरू करते हैं.
Wholemount की सतह पर ~ 5 nl microbead समाधान के बाहरकरें. एक बार मोती के प्रारंभिक सांस बंद मंजूरी दे दी है ependymal प्रवाह से सतह, मनका इंजेक्शन के अतिरिक्त राउंड किया जा सकता है.

चतुर्थ. Immunostaining Wholemounts

Immunostaining के लिए dissected Wholemounts विसर्जन तय रातोंरात के साथ या बिना 0.1% ट्राइटन-X100 4 डिग्री सेल्सियस पर पीएफए में 4% ट्राइटन-X100 के उपयोग प्रतिजनों कि इस उपचार को सहन के लिए पसंद है, लेकिन बाहर मामलों में जहां धुंधला गुणवत्ता डिटर्जेंट से कम है में छोड़ दिया जा सकता है.
निम्नलिखित सुबह, पीएफए 24 अच्छी तरह से थाली से aspirated है और wholemounts 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार धोया जाता है के साथ या 0.1% ट्राइटन-X100 के बिना 0.1 एम पीबीएस में. जैसा कि पहले, ट्राइटन-X100 के उपयोग पसंद है, लेकिन आवश्यकता नहीं है इस प्रोटोकॉल में सभी washes के लिए. इस प्रोटोकॉल के दौरान पूरे समाधान का आदान प्रदानमाउंट अच्छी तरह से की ओर से समाधान के सावधान आकांक्षा की आवश्यकता है. फिर, अच्छी तरह से एक हस्तांतरण wholemount पर अच्छी तरह से नहीं, सीधे पक्ष पर ऐसी है कि समाधान washes angled पिपेट का उपयोग समाधान के साथ refilled है. ध्यान रखना हर समय का सामना करना पड़ wholemount के वेंट्रिकल पक्ष रखने. समाधान की जोरदार pipetting अक्सर wholemount फ्लिप जाएगा. हम wholemount 1 पर सूखने से ऊतक को रोकने के लिए समय पर समाधान का आदान - प्रदान पसंद करते हैं.
बंद पीएफए धोने के बाद, wholemounts 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर incubated अवरुद्ध समाधान में है, के साथ या बिना ट्राइटन-X100 10% सामान्य बकरी या 0.1 एम पीबीएस में गधा सीरम युक्त. यदि आपका धुंधला के लिए ट्राइटन-X100 का उपयोग कर, आप या तो 2 या अवरुद्ध समाधान में 0.5% ट्राइटन-X100% का उपयोग करें चुन सकते हैं. हम 2% ट्राइटन-X100 उपयोग करें जब प्रतिजनों कि गहरी ऊतक में एंटीबॉडी SVZ में स्थित उन प्रतिजनों के रूप में प्रवेश की आवश्यकता के लिए धुंधला हो जाना. हालांकि, जब ependymal कोशिकाओं के शिखर सतह में पाया एंटीजन के रूप में में पार्श्व दीवार की सतह के करीब स्थित प्रतिजनों के लिए धुंधला हो जाना, हम 0.5% ट्राइटन-X100 उपयोग करें. इसके अलावा, ट्राइटन-X100 सेल सतह या अन्य प्रतिजनों कि हटाया या डिटर्जेंट द्वारा बदल के लिए बाहर छोड़ा जा सकता.
अगला, अवरुद्ध समाधान निकालने और एक ही अवरुद्ध समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ने और 4 पर 24 या 48 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन अवधि के विकल्प प्रतिजन, 0.5% या 2% ट्राइटन की पसंद के समान पर निर्भर करता है. Wholemount की सतह पर स्थित प्रतिजनों, 24 घंटे ऊष्मायन suffices. हालांकि, SVZ में के रूप में गहरी ऐसे स्थित प्रतिजनों के लिए, 48 घंटे ऊष्मायन अवधि के बेहतर परिणाम प्रदान करते हैं.
उदाहरण के लिए, शिखर पार्श्व वेंट्रिकल दीवार अस्तर कोशिकाओं की सतह और बेसल शरीर का अध्ययन करने के लिए, बीटा catenin के लिए एंटीबॉडी के साथ दाग, कोशिका झिल्ली लेबल, और γ ट्यूबिलिन, बेसल शरीर लेबल. 0.1 एम पीबीएस 10% सामान्य बकरी सीरम और 0.5% ट्राइटन-X100 युक्त में विरोधी β-catenin माउस (1:500) एंटीबॉडी और खरगोश विरोधी γ-ट्यूबिलिन एंटीबॉडी (1:1000) पतला. 4 ° 24 घंटे के लिए सी में सेते हैं.
वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल, या प्रकार B1 कोशिकाओं दाग, GFAP एंटीबॉडी के साथ पार्श्व दीवार दाग . 0.1 एम पीबीएस 10% सामान्य बकरी सीरम और 2% ट्राइटन-X100 युक्त में विरोधी GFAP माउस एंटीबॉडी (1:500) पतला. 4 बजे ° 48 घंटे के लिए सी सेते हैं .
प्राथमिक एंटीबॉडी से धो रहे हैं शुरू में पीबीएस में या 0.1% ट्राइटन-X100 के बिना 2 जल्दी rinses द्वारा. फिर कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 3 अतिरिक्त washes नहीं है.
एक ही अवरुद्ध प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए इस्तेमाल समाधान में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला और wholemounts को जोड़ने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए के रूप में समय की एक ही लंबाई के लिए 4 में सेते डिग्री सेल्सियस
उदाहरण के लिए, β catenin और γ-ट्यूबिलिन के लिए धुंधला हो जाना के लिए: Alexa Fluor बकरी 488 विरोधी माउस (1:400, माउस पहचानता विरोधी β-catenin) एंटीबॉडी और एलेक्सा Fluor 594 विरोधी खरगोश बकरी एंटीबॉडी पतला ( 1:400, 0.1 एम पीबीएस 10% सामान्य बकरी सीरम और 0.5% ट्राइटन-X100 युक्त में विरोधी γ ट्यूबिलिन खरगोश) को पहचानता है. 4 ° 24 घंटे के लिए सी में सेते हैं.
GFAP immunostaining: पतला एलेक्सा Fluor 488 बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी 0.1 एम पीबीएस 10% सामान्य बकरी सीरम और 2% ट्राइटन-X100 युक्त में (1:400, विरोधी GFAP माउस को पहचानता है). 4 बजे ° 48 घंटे के लिए सी सेते हैं .
माध्यमिक एंटीबॉडी से ही प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए प्रदर्शन washes का उपयोग wholemount धोया जाता है.
अगर वांछित, परमाणु काउंटर - धुंधला DAPI पीबीएस में कमरे के तापमान पर 30 मिनट और फिर पीबीएस में एक बार धोने के लिए जलमिश्रित में incubating द्वारा इस बिंदु पर प्रदर्शन किया जा सकता है है.

वी. confocal माइक्रोस्कोपी के लिए स्लाइड पर Immunostained Wholemounts बढ़ते

उच्च संकल्प इमेजिंग confocal के लिए, 200-300 उम मोटी ऊतक की एक ज़ुल्फ़ के रूप में केवल पार्श्व वेंट्रिकल की पार्श्व दीवार के संरक्षण के लिए उप - dissected की जरूरत wholemounts immunostaining निम्नलिखित. अंतर्निहित striatum से पार्श्व दीवार अलग यह एक स्लाइड पर घुड़सवार और एक फ्लैट तरीके से एक coverslip के साथ कवर की अनुमति देता है.
चिकनी ठीक संदंश, Sharpoint 22.5 ° microsurgical चाकू चाकू, पकवान विदारक माइक्रोस्कोप स्लाइड्स और coverslips, 0.1 एम पीबीएस, और Aquamount बढ़ते मध्यम: immunostained wholemounts और निम्न उपकरण और उपकरणों के साथ stereomicroscope पर लौटें.
24 अच्छी तरह से थाली से विदारक 0.1 एम निलय पक्ष रखने के लिए सावधान किया जा रहा पीबीएस युक्त पकवान wholemount स्थानांतरण.
सबसे पहले, पूरी तरह से पीछे से पूर्वकाल के लिए लाइन जहां महासंयोजिका पार्श्व दीवार मिलता है के साथ ठीक काटने से wholemount के पृष्ठीय प्रांतस्था हटायें. यह callosal सफेद बात और SVZ गुलाबी दिखने के बीच इंटरफेस के रूप में मान्यता प्राप्त है.
फिर wholemount के उदर पहलू भर में एक लंबी क्षैतिज उन्मुख कटौती कर. इस कटौती की सतह प्रदान करेगा एक मंच है जिस पर आप कर सकते हैं सेंटविच्छेदन में अगले कदम के दौरान wholemount abilize.
सामना करना पड़ रहा wholemount की पृष्ठीय सतह के साथ, आप के लिए पूर्वकाल से SVZ की मोटाई कल्पना करने के लिए पार्श्व दीवार के साथ पीछे करने में सक्षम हो जाएगा. नोट करें कि इस दृश्य अंतर्निहित striatum और SVZ देखा जा करने के लिए अनुमति प्रांतस्था के प्रारंभिक हटाने के द्वारा ही संभव बनाया गया था. SVZ ऊतक की पतली बैंड निलय सतह से striatum के लिए विस्तार के रूप में पहचान की है. SVZ एक सजातीय गुलाबी उपस्थिति है जबकि striatum सफेद पदार्थ की डोरियों से घुसपैठ है. ध्यान दें कि SVZ पूर्व से मोटा है और उत्तरोत्तर पतली पीछे हो जाता है.
एक बार जब आप SVZ और striatum के इंटरफेस की पहचान की है, ध्यान से पार्श्व दीवार के सबसे पूर्वकाल पहलू पर इस इंटरफेस में कटौती, पृष्ठीय से उदर चाकू अग्रिम शुरू करते हैं. यह सही कर, अपने दो पिनों के रूप में इस्तेमाल किया संदंश के साथ wholemount स्थिर. तुम भी अपने संदंश का उपयोग थोड़ा wholemount बारी पृष्ठीय पार्श्व दीवार के पार वेंट्रल अग्रिम ब्लेड कल्पना कर सकते हैं. इस विच्छेदन के लिए महत्वपूर्ण है के लिए ऊतक के परिणामस्वरूप ज़ुल्फ़ बहुत सपाट हो. इसका मतलब यह है कि के रूप में आप के लिए पार्श्व दीवार के पार पीछे पूर्वकाल से SVZ टुकड़ा, कटौती आप के उन्मुखीकरण सभी समय निलय की सतह के समानांतर रहना चाहिए.
कि अधिक पीछे याद रखें, SVZ पतली हो जाती है. बल्कि अपने विच्छेदन thinning इस बिंदु पर केवल SVZ में कटौती के लिए रवाना से, यह महत्वपूर्ण है कि के रूप में आप पीछे अग्रिम, dissected किया जा रहा है ऊतक की मोटाई एक ही रहता है. इससे यह सुनिश्चित होगा कि आप बाद में माउंट होगा ऊतक के ज़ुल्फ़ फ्लैट है.
पूरी तरह से अंतर्निहित striatum से पार्श्व दीवार को अलग करने के बाद, ध्यान से इस ज़ुल्फ़ कि निलय की दीवार का हिस्सा नहीं हैं से सभी अन्य आसपास के ऊतकों को हटा दें.
फिर नीचे अपनी संदंश का उपयोग करने से इस ज़ुल्फ़ लेने और यह एक खुर्दबीन स्लाइड के केंद्र में स्थिति. Wholemount पर सीधे aquamount की कुछ बूँदें लागू करें और धीरे से एक इस पर केन्द्रित coverslip जगह है, ऊतक की सतह पर बुलबुले परिचय नहीं की कोशिश कर रहा है. स्लाइड का वजन है कि aquamount disperses समान रूप से सुनिश्चित करने और पार्श्व दीवार की सतह का एक परिष्कृत सपाट उत्पादन होगा. aquamount की राशि का इस्तेमाल किया और coverslip के आकार dissected किया जा रहा है ऊतक की उम्र पर निर्भर है. भ्रूण और जल्दी प्रसव के बाद ऊतकों के लिए, हम aquamount की एक बूंद और एक 22 "x 30" coverslip पसंद करते हैं. भारी coverslips ऊतकों को बिगाड़ना और अधिक aquamount इमेजिंग गुणवत्ता के साथ हस्तक्षेप करेगा कर सकते हैं क्योंकि confocal लेज़रों कम coverslip और ऊतक सतह के बीच aquamount रहने की एक पतली परत घुसना करने में सक्षम हो जाएगा. बाद में प्रसव के बाद और वयस्क ऊतकों के लिए, हम aquamount के 4 बूँदें और एक 24 "x 60" coverslip का उपयोग करें.
स्लाइड्स हैं तो एक स्लाइड पुस्तक में फ्लैट 4 बजे डिग्री सेल्सियस इमेजिंग पहले 1-2 दिनों के लिए coverslips व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए संग्रहीत.

प्रतिनिधि परिणाम

Wholemount दृष्टिकोण वयस्क SVZ के कीटाणु गतिविधि में कई महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है. SVZ में युवा न्यूरॉन्स पलायन की श्रृंखला के नेटवर्क के पहले पार्श्व वेंट्रिकल की पार्श्व दीवार के wholemounts के बाद मनाया गया एंटीबॉडी के साथ polysialylated तंत्रिका कोशिका आसंजन अणु (पीएसए ^NCAM) 1 immunostained थे. Neuroblasts पलायन के इन चेन doublecortin एंटीबॉडी (चित्रा 1) के साथ wholemounts immunostaining करने के बाद भी देखा जा सकता है. उल्लेखनीय है, श्रृंखला के नेटवर्क कोशिकाओं के दो सामान्य धाराओं, एक से अधिक dorsally चल रहा है और एक आसंजन बिंदु के आसपास ventrally चल रहा है के साथ एक टकसाली पैटर्न है. SVZ के Wholemounts भी इस क्षेत्र में progenitors के proliferative गतिविधियों की एक व्यापक दृश्य प्रदान करते हैं, के रूप में चित्रा 2 में Ki67 धुंधला के साथ देखा. दिलचस्प है, दो हाल ही के अध्ययन विभाजित SVZ कोशिकाओं और स्थानीय vasculature ^2,3 (चित्रा 2) के बीच घनिष्ठ संपर्क का सुझाव देते हैं .

जब उच्च शक्ति confocal माइक्रोस्कोपी के तहत जांच, एन चेहरा देखने wholemounts द्वारा प्रदान वेंट्रिकुलर सिस्टम अस्तर कोशिकाओं के शिखर सतह की एक अद्वितीय परिप्रेक्ष्य अनुमति देता है. यह एन चेहरे परिप्रेक्ष्य हाल ही में पता चला है कि SVZ प्रकार B1 कोशिकाओं, वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल, गैर विभाजित ^{विभेदित ependymal} 4 कोशिकाओं के साथ एक मिश्रित neuroepithelium का हिस्सा हैं. प्रकार B1 कोशिकाओं पार्श्व वेंट्रिकल संपर्कों के शिखर सतह और ependymal कोशिकाओं के बड़े शिखर सतहों द्वारा एक pinwheel विन्यास में घिरा हुआ है (चित्रा 3, तीर B1 शिखर सतहों से संकेत मिलता है). इसके अलावा, ependymal कोशिकाओं के शिखर की सतह के करीब परीक्षा से पता चला है कि translational स्थिति और अपने बेसल शरीर के घूर्णी अभिविन्यास उनके planar ⁵ polarity के संकेतक हैं. Ependymal सेल बेसल बोमर जाता शिखर सतह पर एक पैच में clustered रहे हैं. इस पैच शिखर की सतह के बहाव के "दिशा में केंद्र से सी.एस.एफ. प्रवाह (translational polarity) के लिए सम्मान के साथ विस्थापित है, इस पैच के भीतर, प्रत्येक बेसल शरीर अपने लंबे अक्ष के बारे में घुमाया है ऐसी है कि बेसल पैर, बेसल की एक सहायक शरीर, प्रवाह की दिशा (घूर्णी polarity) में अंक पड़ोसी ependymal कोशिकाओं को एक ही दिशा में अपने बेसल उन्मुख शरीर है.. महत्वपूर्ण बात, ependymal प्रवाह परख के videomicrographs सीधे पार्श्व दीवार के एक विशिष्ट क्षेत्र में प्रवाह की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है उस क्षेत्र में ependymal सेल बेसल निकायों (चित्रा 4) के उन्मुखीकरण के लिए .

वयस्क दिमाग में उच्च शक्ति इमेजिंग के साथ सबसे बड़ा कीटाणु क्षेत्र के एक Panoramic परिप्रेक्ष्य, प्रदान करने के अलावा, wholemounts SVZ में अलग - अलग सेलुलर morphologies का एक और अधिक पूर्ण और विस्तृत विश्लेषण की अनुमति देते हैं. Wholemounts पर GFAP immunostaining के उच्च शक्ति confocal इमेजिंग पता चला है कि प्रकार कोशिकाओं B1, के अलावा उनके छोटे वेंट्रिकल संपर्क शिखर प्रक्रिया, रक्त वाहिकाओं (चित्रा 5) ⁴ के साथ संपर्क में एक लंबे बेसल प्रक्रिया है. यह cytoarchitecture पहले राज्याभिषेक वर्गों में की सराहना नहीं किया गया था क्योंकि बेसल प्रक्रिया ज्यादातर निलय की दीवार के समानांतर चलाता है. सीरियल सेक्शनिंग इसलिए छोटे टुकड़ों में व्यक्ति की कोशिकाओं में कटौती, यह लगभग असंभव एक सेल पूरा आकारिकी के पुनर्निर्माण के लिए, या SVZ में अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए अपने रिश्ते को समझने बना. wholemount दृष्टिकोण शास्त्रीय सेक्शनिंग तकनीक पर कई फायदे है, दोनों कम शक्ति माइक्रोस्कोपी और उच्च शक्ति माइक्रोस्कोपी के साथ व्यक्ति की कोशिकाओं के एक पूर्ण परिप्रेक्ष्य के साथ नयनाभिराम दृश्य को उपलब्ध कराने में है. इस तकनीक के लिए इस वयस्क मस्तिष्क कीटाणु क्षेत्र के भविष्य के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण पूरक होना जारी रहेगा.

चित्रा 1 SVZ में प्रवासी neuronal श्रृंखला के नेटवर्क. टाइलों confocal छवियों को एक पार्श्व दीवार wholemount कि doublecortin, जो SVZ भर में पलायन neuroblasts लेबल एंटीबॉडी के साथ दाग था पुनर्निर्माण किया. प्रवास के दो सामान्य धाराओं, पर एक dorsally चल रहा है और एक आसंजन बिंदु के आसपास ventrally चल रहा है, तारांकन (*) ने संकेत दिया है. तीर पूर्वकाल (क) और पृष्ठीय (घ) दिशाओं से संकेत मिलता है. स्केल बार = 1 मिमी.

चित्रा 2 vasculature और SVZ में विभाजित कोशिकाओं के बीच संबंध . यह पार्श्व दीवार wholemount Ki67 के लिए एंटीबॉडी के साथ immunostained था, माउस immunoglobulins के खिलाफ हरे रंग में विभाजित कोशिकाओं और एंटीबॉडी लेबल, लाल रंग में vasculature लेबल. क्योंकि यह wholemount पहले धुंधला हो जाना करने के लिए खारा के साथ perfused नहीं था, अंतर्जात माउस आईजीजी अणुओं रक्त वाहिकाओं के भीतर रह रहे हैं और माध्यमिक विरोधी माउस एंटीबॉडी द्वारा दाग. हाल के काम से पता चलता है कि विभाजित SVZ व्यापारियों (हरा) रक्त वाहिकाओं के लिए करीब निकटता (लाल) {शेन, 2008 +६५२३ #} {Tavazoie, 2008 6522 #} में स्थित हैं. तीर पूर्वकाल (क) और पृष्ठीय (घ) दिशाओं से संकेत मिलता है. स्केल बार = 1 मिमी.

चित्रा 3. निलय - संपर्क पार्श्व दीवार पर कोशिकाओं के शिखर सतह. Wholemount के उच्च शक्ति confocal छवि β-catenin के लिए immunostained, हरे रंग में कोशिका झिल्ली लेबल, और γ-ट्यूबिलिन, लाल रंग में बेसल शरीर लेबल, इन उपकला कोशिकाओं के तलीय संगठन से पता चलता है. प्रकार B1 कोशिकाओं, वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल, एक एकल बेसल शरीर के साथ एक छोटे से शिखर सतह, तीर द्वारा इंगित किया है. इन कोशिकाओं के शिखर सतह एक pinwheel विन्यास में बड़े ependymal कोशिकाओं के शिखर सतह से घिरा हुआ है. Ependymal कोशिकाओं planar उनके शिखर सतह पर एकाधिक बेसल शरीर की स्थिति से संकेत polarity है. पड़ोसी ependymal कोशिकाओं अपने बेसल शरीर के शिखर की सतह के एक ही ओर (नीचे और इस क्षेत्र में बाई ओर) पर स्थित समूहों, सी.एस.एफ. प्रवाह {Mirzadeh, 2010 6573 #} की दिशा करने के लिए इसी है. स्केल बार = 10 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 4 ependymal प्रवाह परख. समग्र छवि एक ependymal प्रवाह परख के दौरान लिया फिल्म से 100 अनुक्रमिक तख्ते विलय के द्वारा बनाई गई. प्रतिदीप्त microbeads जमा पृष्ठीय और आसंजन क्षेत्र को पीछे ependymal cilia द्वारा दो उन्मुख धाराओं, पर एक और एक आसंजन के तहत में स्वचालित मोनरो के रंध्र की ओर. यह उन्मुख प्रवाह ependymal कोशिकाओं के कार्यात्मक planar polarity से पता चलता है. प्रत्येक प्रवाह लाइन एक एकल मनका के समय में लगातार बिंदुओं पर स्थिति को दर्शाया गया है. स्केल बार = 0.5 मिमी.

5 चित्रा GFAP. + प्रकार B1 कोशिकाओं को रक्त वाहिकाओं पर अंत पैर के साथ एक लंबे बेसल फाइबर है . GFAP SVZ astrocytes लेबल एंटीबॉडी के साथ एक उच्च शक्ति confocal एक पार्श्व दीवार wholemount से लिया ढेर की अधिकतम प्रक्षेपण immunostained. यह धुंधला हो जाना वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल, लेबल, या प्रकार B1 कोशिकाओं, एक लंबे GFAP बेसल फाइबर है कि रक्त वाहिकाओं (तीर) पर समाप्त होता है + जो निलय सतह पर एक शिखर समाप्त होने है, और जैसा कि यहाँ दिखाया रक्त वाहिकाओं यहाँ दाग रहे हैं क्योंकि माध्यमिक एंटीबॉडी कल्पना करने के लिए माउस विरोधी GFAP एंटीबॉडी vasculature के भीतर अंतर्जात माउस आईजीजी पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया. स्केल बार = 50 सुक्ष्ममापी.

Discussion

निलय और subventricular क्षेत्रों में neurogenesis के अधिकांश अध्ययन शास्त्रीय सेक्शनिंग तकनीक पर भरोसा करने के लिए microanatomy और इन क्षेत्रों में सेलुलर संबंधों की जांच कर रहे हैं. यहाँ हम एक वैकल्पिक तकनीक, पहली बार ¹ SVZ में उत्पन्न neuroblasts के प्रवासी श्रृंखला के नेटवर्क का विश्लेषण किया, तो विरोधी mitotic ⁶ उपचार, और सबसे हाल ही सटीक शिखर अध्ययन किया निम्नलिखित SVZ पूर्वज आबादी के उत्थान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया वर्णन और वयस्क SVZ तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं ^2,3,4 के बेसल सेल सेल बातचीत. दिलचस्प है, इस तकनीक से पता चला है कि तंत्रिका स्टेम सेल, या वयस्क SVZ के प्रकार बी 1 कोशिकाओं, विभेदित गैर विभाजित ependymal कोशिकाओं के साथ एक मिश्रित neuroepithelium का हिस्सा हैं. एन चेहरे इमेजिंग wholemounts का उपयोग कर दिखाया गया है कि इस मिश्रित neuroepithelium pinwheel प्रकार B1 ependymal ⁴ कोशिकाओं के बड़े शिखर सतहों से घिरे कोशिकाओं के शिखर अंत से मिलकर वास्तुकला है. यह एन चेहरे विश्लेषण निलय सतह पर शिखर अंत और बेसल प्रक्रियाओं एक संवहनी आला से संपर्क के साथ कोशिकाओं के निर्वाचकगण के रूप में भ्रूण और वयस्क दिमाग में तंत्रिका स्टेम सेल के वंश की हमारी समझ को स्पष्ट किया है. इन निष्कर्षों को लगभग असंभव होता है शास्त्रीय सेक्शनिंग तकनीकों का उपयोग. Wholemounts भी उनके वेंट्रिकल से संपर्क शिखर प्रक्रिया के माध्यम से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की पहचान की सुविधा. के रूप में इन स्टेम कोशिकाओं के लिए और अधिक विशिष्ट मार्करों पाए जाते हैं, wholemounts की पहचान करने और तंत्रिका स्टेम सेल के व्यवहार के विश्लेषण का एक अभिन्न हिस्सा होगा.

पार्श्व वेंट्रिकल की दीवारों के Wholemounts भी ependymal कोशिकाओं के तलीय polarity के अध्ययन के लिए आदर्श परिप्रेक्ष्य प्रदान करते हैं. Ependymal कोशिकाओं multiciliated निलय है कि एक समन्वित तरीके से सी.एस.एफ. प्रेरित समारोह अस्तर कोशिकाओं रहे हैं. Wholemount तकनीक के साथ, पूरे ependymal उपकला एन चेहरा उजागर हो रहा है और और दाग किया जा सकता है है पीछे करने के लिए पृष्ठीय वेंट्रल सीमाओं के लिए अपनी पूर्वकाल से व्यापक अध्ययन. इसके अलावा, ependymal प्रवाह assays तीव्रता dissected पर प्रदर्शन, जीना wholemounts robustly planar polarized ependymal cilia द्वारा उत्पन्न के प्रवाह को प्रदर्शित करता है. हाल ही wholemount दृष्टिकोण का उपयोग कर काम इस ependymal planar ⁵ polarity के सेलुलर निर्धारकों का पर्दाफाश किया है . दिलचस्प है, wholemount अध्ययनों से यह भी सुझाव दिया है कि ependymal उत्पन्न सी.एस.एफ. प्रवाह chemorepellents के gradients कि ⁷ SVZ में युवा न्यूरॉन्स के प्रवास गाइड स्थापित है . Wholemount दृष्टिकोण है कि शुरू में प्रवासी neuronal श्रृंखला के नेटवर्क की पहचान इसलिए श्रृंखला प्रवास को विनियमित तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए जारी कर रहे हैं.

VZ और SVZ के wholemount इमेजिंग द्वारा विश्लेषण दोनों भविष्य के अध्ययन और एक मौजूदा अध्ययन के बारे में हमारी समझ को स्पष्ट करने के लिए एक नया दृष्टिकोण कहते हैं. उदाहरण के लिए, हाल के एक अध्ययन का सुझाव दिया है कि वयस्क SVZ में तंत्रिका ^{स्टेम} कोशिकाओं निलय 8 के साथ संपर्क में CD133 + / CD24 कोशिकाओं रहे थे. वर्गों में अपने immunostaining के आधार पर, इन लेखकों ने दावा किया है कि इन कोशिकाओं multiciliated ependymal कोशिकाओं के एक subpopulation थे. हालांकि, हमारे wholemount दृष्टिकोण है, जो पूरे ependymal उपकला के एक अधिक व्यापक देखने देता का उपयोग अध्ययन में हमने पाया कि सभी ependymal CD24 व्यक्त कोशिकाओं और केवल निलय संपर्क कोशिकाओं है कि CD133 थे + / CD24-थे प्रकार B1 का एक सबसेट ⁴ कोशिकाओं. इसके अलावा, wholemount तकनीक भविष्य हाल ही में वर्णित तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के वयस्क मस्तिष्क ^में 9 मोज़ेक संगठन की जांच के अध्ययन में उपयोगी हो वादा किया है. कई अध्ययनों से पता चला है कि वयस्क मस्तिष्क में तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को एक सजातीय आबादी नहीं हैं, लेकिन क्षेत्रीय निर्दिष्ट कर रहे हैं और सामान्य रूप से घ्राण बल्ब interneurons के केवल विशिष्ट उपप्रकारों का उत्पादन. इन अध्ययनों का प्रस्ताव है कि तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के विभिन्न subpopulations विशिष्ट ^{प्रतिलेखन} 10,11,12,13,14 और / कारकों की अभिव्यक्ति के द्वारा या उनके पृष्ठीय उदर और पूर्वकाल - पीछे विस्तार के साथ क्षेत्रीय स्थानीयकरण द्वारा या तो प्रतिष्ठित हो सकता है पार्श्व ^9,15,16 दीवार. वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के क्षेत्रीय निर्दिष्ट subpopulations अधिक आणविक मार्कर के रूप में पहचाने जाते हैं, wholemount इमेजिंग निलय दीवार के साथ इन अलग पूर्वज डोमेन parcelation के एक व्यापक दृश्य प्रदान करना चाहिए.

wholemount विच्छेदन और यहाँ प्रस्तुत इमेजिंग तकनीक भी भ्रूण में निलय दीवारों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. भ्रूण पार्श्व दीवार के विच्छेदन कदम दर कदम, एक ही तरीके से किया जाता है. वहाँ केवल कठिनाई के स्तर में मामूली मतभेद हैं, भ्रूण निलय अपेक्षाकृत विच्छेदन आसान बनाने के बड़े होते हैं, लेकिन ऊतक नरम है हेरफेर और अधिक मुश्किल बना है. विशेष रूप से, पार्श्व वेंट्रिकल के एक समान जोखिम Embry में इस्तेमाल किया जा सकता हैओएस cortical neurogenesis के अध्ययन के वेंट्रिकल की cortical दीवार को काटना. हाल ही में सबूत से पता चलता है कि असममित ^centrosome इनहेरीटेंस cortical 17 neurogenesis के दौरान निलय की सतह पर रेडियल glia रखता है. रेडियल glial शिखर सतहों के एन सामना इमेजिंग कैसे इन कोशिकाओं के भीतर विभाजन centrosomes asymmetrically विरासत में मिला रहे हैं में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है.

अधिकांश तकनीक, विशेष रूप से उन सटीक निपुणता शामिल के साथ के रूप में महारत अभ्यास की आवश्यकता है. वहाँ रहे हैं, तथापि, विच्छेदन में कुछ तत्व है कि बेहतर परिणाम के लिए महत्वपूर्ण हैं: 1) प्रकाश छाया बनाने के लिए नमूने की रोशनी समायोजन ऊतक के विच्छेदन कि अन्यथा अपेक्षाकृत सजातीय है, 2 के दौरान अमूल्य विपरीत प्रदान करता है) की तरह संदंश का उपयोग इस तकनीक में दो कीट संदंश पिन के लिए एक साथ चुटकी या ऊतक लेने के लिए इस्तेमाल कभी नहीं किया हैं, लेकिन maneuverable पिंस है कि लगातार ऊतकों को स्थिर करने के लिए पुनः समायोजन किया जा सकता है के रूप में इस्तेमाल किया जबकि काटने, 3) कोमल त्याग की एक संतुलन और चाकू काटने नहीं होना चाहिए केवल लेकिन यह भी कटौती कोमल तर्क प्रदान करने के लिए, याद है कि इस विच्छेदन के बहुमत वास्तव में केवल आंतरायिक काटने के साथ कोमल त्याग के माध्यम से प्रदर्शन औसत दर्जे का है और पार्श्व दीवारों को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा.

Acknowledgments

एनआईएच एच.डी. 32,116 अनुदान, सैंडलर परिवार फाउंडेशन, जॉन Bowes स्टेम सेल फंड, MEXT, MHLW, और HFSP सहायक द्वारा समर्थित कार्य करें. ZM कार्लोस Baldoceda फाउंडेशन और UCSF Krevans फैलोशिप द्वारा समर्थित है. ए.ए. बी. धारण हीथ और मेलनी संपन्न चेयर बेतरतीबी.