Flash-Freezing und Kryoschneiden E12.5 Gehirn der Maus

Summary

Nachgewiesene in diesem Video sind die Techniken für Flash Einfrieren und Schneiden embryonalen Hirngewebe von Mäusen. Nützliche Tipps für die Verwendung des Kryostaten gegeben sind, einschließlich Methoden zur Problembehandlung, mit denen während des Schneidens, um sicherzustellen, dass das resultierende Gewebe Abschnitte frei von Rissen und anderen Verzerrungen können.

Protocol

1. Fix Gewebe in 4% Paraformaldehyd in PBS für die gewünschte Zeit.
2. Sucrose ziehen Gewebe (Gefrierschutz)
   1. Machen Sie 30% Saccharose-Lösung in PBS w / v in 2059 Rohr.
   2. Das Gewebe spülen 3x in PBS (~ 5 min mit Schaukeln).
   3. Legen Gewebe in 30% Saccharose-Lösung. Tissue wird nicht sinken.
   4. Legen Sie das Gewebe in 4 ° C über Nacht oder bis es gesunken ist.
3. Label entsprechender Größe cryomold mit Information und Orientierung.
4. Füllen cryomold mit OCT (Luftblasen vermeiden).
5. Transfer-Gewebe der OCT-Bad ein und überziehen es mit OCT
6. Transfer-Gewebe OCT in cryomold.
7. Orient das Gewebe unter dem Mikroskop.
8. Gießen flüssiger Stickstoff in Kunststoff-Petrischale.
9. Schnell und vorsichtig das Gewebe in cryomold in den Stickstoff. (Nicht tauchen oben auf der cryomold.)
10. Wenn der OCT solide ist weiß, legen Sie die gefrorenen Gewebe in -80 ° C Tiefkühltruhe für die Lagerung.
11. Äquilibrieren Gewebe zu ~ 20 ° C für mindestens 30 min. vor dem Schneiden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue-Tek Cryomold	Ted Pella, Inc.	27181
O.C.T.	Ted Pella, Inc.	27050
Sucrose solution			30% sucrose solution in PBS w/v
paraformaldehyde			4% paraformaldehyde in PBS