Summary
Abstract
أرشيف المكتبات Metagenomic شظايا كبيرة من تسلسل الجيني متجاورة من الكائنات الدقيقة دون الحاجة إلى زراعة السابقة. توليد إجراء مبسط لإنشاء مكتبات والفرز metagenomic بالتالي مفيدة للتحقيقات عالية الكفاءة الإنتاجية في الخصائص الوراثية والتمثيل الغذائي لتجمعات الجراثيم غير مثقف. هنا ، تعرض البروتوكولات الرئيسية في الفيديو ، الذي نقترحه هو الشكل الأكثر فائدة لوصف دقيق لعملية طويلة تعتمد على الأجهزة الروبوتية بالتناوب والتدخلات اليدوية (الإنسان). أولا ، استخدمنا الروبوتات على الفور على استنساخ مكتبة macroarray الأغشية ذات الكثافة السكانية العالية ، كل منها يمكن أن تحتوي على المستعمرات مكررة 20-4 لوحات المكتبة 384 أيضا. أتمتة أمر ضروري لهذا الإجراء ليس فقط من أجل الدقة والسرعة ، ولكن أيضا بسبب صغر الحجم المطلوب لاحتواء عدد كبير من الحيوانات المستنسخة في مكتبة الترتيبات المكانية كثيفة للغاية. ولدت مرة واحدة ، ونحن تظاهر القادمة كيف يمكن فحص الأغشية macroarray عن الجينات ذات الاهتمام باستخدام نسخ معدلة من البروتوكولات القياسية لوسم التحقيق التهجين الغشاء ، والكشف عن الإشارة. نحن تستكمل المظاهرة البصرية من هذه الإجراءات مع أوصاف مكتوبة مفصلة من الخطوات المعنية والمواد المطلوبة ، وكلها متاحة على شبكة الإنترنت جنبا إلى جنب مع الفيديو.
Protocol
1. التهجين الداخلي
وسوف تتخذ أنبوب واحد التهجين 1 أو 2 الأغشية (حجم 22 من 22 سم). استخدام 50 مل من مزيج التهجين و 0.5 ملغ من الحمض النووي التحقيق (10 نانوغرام / مل تركيز النهائي) في أنبوب التهجين. للحصول على أفضل النتائج ، استخدم هلام تنقية الحمض النووي والتحقيق. إذا رفع مستوى إعداد التحقيق ، وزيادة عدد من أنابيب بدلا من زيادة كمية المواد الكاشفة في الأنبوب.
إعداد المسبار (0.5 ملغ DNA) :
- تمييع 15 ميكرولتر عبر رابط حل مع 60 ميكروليتر من الماء.
- تمييع DNA إلى 10 نانوغرام / ميكرولتر مع الماء لحجم إجمالي 50 ميكرولتر في microtube المسمار المغطاة.
- تفسد الحمض النووي لمدة 5 دقائق في الماء المغلي.
- نقل بسرعة إلى جليد والسماح لتبرد لمدة 5 دقائق. تدور لفترة وجيزة.
- إضافة 50 ميكرولتر العازلة للتفاعل ومزيج بلطف.
- أضف 10 ميكرولتر من العلامات كاشف ومزيج بلطف.
- إضافة 50 ميكروليتر من الحل عبر رابط المخفف من الخطوة (1) ومزيج بلطف. وتدور الدوامة برفق لفترة وجيزة.
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تبقي على الجليد لمدة تصل إلى 2 ساعة أو إضافة حجم مساو من الجلسرين 100 ٪ وتخزينها في -20 درجة مئوية.
ملاحظة : استخدام المياه المتوفرة مع الطقم. إبقاء كل الكواشف على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك.
إعداد الغشاء والتهجين
- سخن 50 مل من العازلة التهجين والتهجين أنبوب إلى 60 درجة مئوية.
- إضافة إلى تهجين العازلة أنبوب التهجين. نشمر عن غشاء (ق) وإضافة إلى أنبوب التهجين. (إذا مضيفا 2 الأغشية في الأنبوب ، ولفة واحدة first الغشاء تماما ، ولفة بعد ذلك الغشاء الأخرى على أعلى في نفس الاتجاه.)
- احتضان أنبوب التهجين عند 60 درجة مئوية لمدة نصف ساعة على الأقل (تأكد من الحصول على غارقة غشاء (ق) بدقة.)
- نقل حوالي 1 مل من التهجين مع العازلة ماصة طويلة من التهجين أنبوب إلى أنبوب يحتوي على التحقيق المسمى. وتدور الدوامة برفق لفترة وجيزة. نقل الخليط مرة أخرى إلى أنبوب التهجين.
- احتضان عند 60 درجة مئوية خلال الليل.
ملاحظة : استخدم ملقط والقفازات عند التعامل مع الأغشية. مزيج من المحتوى أنابيب التهجين بلطف لأن الكثير من الإثارة تسبب تشكيل رغوة دائمة غير مرغوب فيها. وينبغي أن يضاف الأغشية في حالة رطبة ؛ نقع في المخزن التهجين أو الماء إذا لزم الأمر وتصريف السائل الزائد قبل ان يضيف.
2. الكشف الداخلي
غسل الأغشية
- سخن العازلة الغسيل الابتدائي إلى 60 درجة مئوية. (استخدام المايكرويف و / أو لوحة التسخين.)
- إذا كان هناك 2 الأغشية في التهجين أنبوب واحد ، نقل أحد إلى الغشاء ، مسخن نظيفة ، وتهجين أنبوب فارغ.
- شطف لفترة وجيزة أنبوب التهجين مع حوالي 50 مل من غسل العازلة الأولية.
- أضف حوالي 100 مل من المخزن الرئيسي لغسل أنبوب التهجين واحتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- كرر الخطوة 3 و 4.
- نقل غشاء لغسل الحاويات واحتضان مع ما لا يقل عن 250 مل من غسل العازلة الثانوية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- كرر الخطوة 6.
ملاحظة : يمكن الاحتفاظ الأغشية العازلة في غسل الثانوية في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى ساعة ونصف قبل توليد الإشارات.
توليد الإشارات والكشف عن (إجراء لمدة الغشاء)
- الشريط قطعتين من SaranWrap شقة على سطح الطاولة (واحد للخطوة 2 واحدة للخطوة 4).
- استنزاف بعناية قبالة عازلة الفائض من الغشاء عن طريق لمس زوايا الغشاء ضد الجانب من الحاويات ونقل الغشاء على لSaranWrap (الجانب عينة متابعة).
- صب 6-7 مل من كاشف ECF على الغشاء وأمثالها على مدى التفاف ساران الغشاء. توزيع بعناية كاشف ECF على الغشاء عن طريق تحريك بلطف Kimwipe خلال SaranWrap. احتضان لمدة 5 دقائق.
- تصريف فائض كاشف ECF من الغشاء ونقلها إلى SaranWrap جديدة ، والتفاف أضعاف خلال الغشاء ، وختم حواف مع الشريط. تغطية غشاء بورق الألمنيوم. احتضان لمدة 1-2 ساعات.
- إعداد لوحة زجاج الماسحة الضوئية عن طريق توزيع 1-2 مل من كاشف ECF على لوحة زجاجية. ثم نقل الغشاء على لوحة من الزجاج (الجانب عينة لأسفل) وتوزيع آخر مل من كاشف 1-2 ECF على الغشاء. تراكب مع SaranWrap ودفع بعناية جميع فقاعات الهواء بعيدا عن الغشاء. (يمكنك وضع لوحة شديدة على رأس SaranWrap للحفاظ على غشاء تضغط على لوحة من الزجاج).
- استخدام FLA - 5100 الماسح الضوئي مضان فوجي ("1 1 صورة ليزر" واسطة) مع الإعدادات التالية : الإثارة 473 نانومتر ، والكشف عن تصفية LPB (510 نانومتر) ، والقرار 50 ميكرون ، 16 بت التخرج إشارة ، CH1 400 V. (المسح الضوئي يستغرق حوالي 15-20 دقيقة في غشاء من حجم 22 سم بحلول 22).
اختياري : - اسمحوا الجلوس لمدة 2-4 ساعات (أو أكثر).
- تكرار الفحص كما في الخطوة 6.
3. تجريد وتخزين الداخلي (NUF إصدار)
- غشاء نقل آخرون إلى 100 ٪hanol ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة مع الإثارة لطيف.
- استبدال الطازجة الإيثانول بنسبة 100 ٪ واحتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. (قد تبقى في غشاء الايثانول لعدة أيام.)
- استبدال الإيثانول مع الماء المقطر ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- إضافة 100 مل من الماء و 5 مل من 10 ٪ SDS (SDS النهائية 0.5 ٪) إلى أنبوب التهجين والمزيج بلطف. إضافة الغشاء.
- في احتضان 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- غشاء نقل إلى حاوية نظيفة وفارغة.
- إضافة 500 مل من الماء و5 مل من 10 ٪ SDS (SDS النهائية 0.1 ٪) كوب والحرارة ليغلي قوية في المايكرويف.
- صب القريبة من الغليان حل SDS 0.1 ٪ خلال الغشاء وتستنهض الهمم بلطف لعدة دقائق. السماح لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
- في شطف لا يقل عن 250 مل من 100 درجة الحموضة العقيمة تريس 8 مم على الأقل 10 دقيقة.
- التفاف في الغشاء SaranWrap وحواف وثيق مع الأشرطة بعناية. المحل في 4 درجات مئوية. (يجب أن لا تجف الأغشية).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لم يتم تجريد الإجراء الأمثل. ومع ذلك ، فإن الإجراء الوارد في تجريد تعليمات الشركة المصنعة (2 يغسل كل من ، في 10 دقيقة في الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، و 1 من 1 يغسل ساعة عند 60 درجة مئوية في 0.5 ٪ SDS) غير كافية. على الأقل الحضانة بين عشية وضحاها في الإيثانول بنسبة 100 ٪ من الضروري حل ناتج التفاعل ECF ؛ عدة أيام الحضانة في الإيثانول بنسبة 100 ٪ ويبدو أن له أي آثار سلبية على القدرة على reprobe الغشاء. الشركة المصنعة SDS العلاج ويبدو أيضا أن تكون كافية. وقد حاولت NUF 1 ساعة عند 80 درجة مئوية مع 0.5 ٪ SDS تليها علاج واحد مع قرب الغليان SDS 0.1 ٪ مع النجاح. وقد أظهرت تريسي التي تتدفق مرة واحدة ، مع أكثر من قرب الغليان SDS 0.1 ٪ غير كافية.
تلميحات مفيدة :
يجب أن يكون محمى من التهجين العازلة والأنابيب التهجين ، وغسل العازلة الأولية إلى 60 درجة مئوية قبل الاستخدام ، ويجب أن تبقى في ذلك درجات الحرارة في كافة مراحل التجربة. على سبيل المثال ، والحفاظ على مخازن على طبق من التدفئة مع ترمومتر مغمورة ، على طبق من التدفئة كورنينج ، وتحديد النتائج حوالي 3 في 60 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| AlkPhos Direct Labelling Reagents | kit | Amersham | RPN3680 | Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C. |
| ECF Substrate | kit | Amersham | RPN3685 | Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer.Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm). |
| 20x Secondary Wash Buffer | buffer | 121 g Tris(final 1 M), 117 g NaCl(final 2 M).Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months. | ||
| 0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 | buffer | 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature. | ||
| 1 M MgCl2 | 50.8 g MgCl2.6H2OAdjust to 250 ml with water. Store at room temperature. | |||
| 10% (w/v) SDS | 20 g SDSAdjust to 200 ml with water. Store at room temperatur | |||
| Combination pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685 | ||||
