Grands écrans des banques métagénomiques

Summary

Abstract

Métagénomique fragments bibliothèques grande archive de séquences génomiques contiguës à partir de microorganismes sans nécessiter de culture préalable. Génération d'une procédure simplifiée pour la création et le criblage de métagénomique est donc utile pour l'efficacité à haut débit des enquêtes sur les propriétés génétiques et métaboliques des assemblages microbiens incultes. Ici, les protocoles clés sont présentés sur vidéo, que nous proposons est le format le plus utile pour décrire avec précision un long processus qui dépend alternativement sur l'instrumentation et les interventions manuelles robotisées (humain). Premièrement, nous avons utilisé la robotique de repérer les clones de bibliothèques sur des membranes macroarray haute densité, dont chacune peut contenir des colonies reproduire vingt à quatre plaques bibliothèque de 384 puits. L'automatisation est essentielle pour cette procédure non seulement pour la précision et la vitesse, mais aussi en raison de la miniaturisation d'échelle nécessaires pour s'adapter au grand nombre de clones de la banque en très dense arrangements spatiaux. Une fois produite, nous avons ensuite montré comment les membranes macroarray peuvent être criblés pour des gènes d'intérêt en utilisant des versions modifiées des protocoles standard pour l'étiquetage de sonde, l'hybridation membrane, et la détection du signal. Nous avons complété la démonstration visuelle de ces procédures avec des descriptions détaillées écrite des étapes et le matériel requis, qui sont tous disponibles en ligne aux côtés de la vidéo.

Protocol

1. Procédure d'hybridation

Un tube d'hybridation aura 1 ou 2 membranes (taille 22 par 22 cm). Utilisez 50 ml de mélange d'hybridation et de 0,5 mg d'ADN de la sonde (10 ng / ml de concentration finale) par tube d'hybridation. Pour de meilleurs résultats, utilisez un gel ADN purifié comme sonde. Si l'échelle jusqu'à la préparation de sonde, d'augmenter le nombre de tubes plutôt que d'augmenter la quantité de réactifs par tube.

Sonde de préparation (0,5 mg ADN):

1. Diluer 15 pi de cross-linker solution avec 60 pl d'eau.
2. Diluer l'ADN à 10 ng / ul avec de l'eau à 50 volume total ul dans un microtube à bouchon à vis.
3. Dénaturer l'ADN pendant 5 min dans l'eau bouillante.
4. Transfert rapide de la glace et laisser refroidir pendant 5 min. Spin brièvement.
5. Ajouter 50 ul de tampon de réaction et mélanger doucement.
6. Ajouter 10 ul de réactif de marquage et mélanger doucement.
7. Ajouter 50 ul de la dilution réticulant solution de l'étape 1 et mélanger délicatement. Vortex doucement et centrifuger brièvement.
8. Incuber à 37 ° C pendant 30 min.
9. Restez sur la glace pendant 2 h ou ajouter un volume égal de glycérol à 100% et conserver à -20 ° C.
   
   Remarque: Utilisez l'eau fournie avec le kit. Conservez tous les réactifs sur la glace, sauf indication contraire.

Préparation de membrane et d'hybridation

1. Préchauffer 50 ml de tampon d'hybridation et de tube d'hybridation à 60 ° C.
2. Ajouter le tampon d'hybridation pour le tube d'hybridation. Rouler à membrane (s) et ajouter à tube d'hybridation. (Si vous ajoutez deux membranes par tube, premier rouleau jusqu'à une membrane complètement, puis rouler la membrane d'autres sur le dessus dans la même direction.)
3. Incuber le tube d'hybridation à 60 ° C pendant au moins ½ h. (Assurez-vous que la membrane (s) se mouiller à fond.)
4. Transférer environ 1 ml de tampon d'hybridation avec une pipette à long du tube d'hybridation pour le tube contenant la sonde marquée. Vortex doucement et centrifuger brièvement. Transférer le mélange revenir à tube d'hybridation.
5. Incuber à 60 ° C pendant la nuit.
   
   Remarque: Utilisez une pince et des gants lorsque vous manipulez des membranes. Mélanger le contenu des tubes d'hybridation douce, car trop d'agitation va provoquer la formation permanente de mousse indésirables. Membranes devraient être ajoutés à l'état humide; tremper dans le tampon d'hybridation ou de l'eau si nécessaire et drainer l'excès de liquide avant d'ajouter.

2. Procédure de détection

Membranes laver

1. Préchauffer le tampon de lavage des primaires à 60 ° C. (Utilisez four micro-ondes et / ou plaque chauffante).
2. S'il ya deux membranes dans un tube d'hybridation, transférer une membrane pour un environnement propre, préchauffé, tube d'hybridation vide.
3. Rincer brièvement tube d'hybridation avec environ 50 ml de tampon de lavage primaire.
4. Ajouter environ 100 ml de tampon de lavage primaire au tube d'hybridation et incuber à 60 ° C pendant 10 min.
5. Répétez l'étape 3 et 4.
6. Transfert à membrane pour le lavage de conteneurs et incuber avec au moins 250 ml de tampon de lavage secondaire à la température ambiante pendant 5 min.
7. Répétez l'étape 6.
   
   Remarque: Les membranes peuvent être conservés dans le tampon de lavage secondaire à température ambiante pendant jusqu'à ½ h avant la génération du signal.

La génération de signaux et de détection (procédure pour une membrane)

1. Deux morceaux de ruban SaranWrap à plat sur la table (un pour l'étape 2 et un pour l'étape 4).
2. Soigneusement drainer l'excès de tampon de la membrane par toucher les coins de la membrane contre le côté du conteneur et transférer la membrane sur la SaranWrap (côté de l'échantillon vers le haut).
3. Verser ml 6-7 de réactifs ECF sur la membrane et plier Saran sur la membrane. Soigneusement distribuer réactif ECF sur la membrane par un léger déplacement d'une Kimwipe sur le SaranWrap. Incuber pendant 5 min.
4. Égoutter l'excès de réactifs ECF de la membrane et le transférer sur de nouveaux SaranWrap, enveloppez fois sur la membrane, et sceller les bords avec du ruban adhésif. Couvrir la membrane avec du papier aluminium. Incuber pendant 1-2 heures.
5. Préparer la vitre du scanner en distribuant 1-2 ml de réactif ECF sur la plaque de verre. Puis transfert de la membrane sur la plaque de verre (côté de l'échantillon vers le bas) et de distribuer une autre 1-2 ml de réactif ECF sur la membrane. Superposition avec SaranWrap et poussez délicatement toutes les bulles d'air loin de la membrane. (Vous pouvez placer une plaque rigide sur le dessus du SaranWrap pour maintenir la membrane plaquée contre la plaque de verre.)
6. Utilisez le Fuji FLA-5100 scanner de fluorescence ("1 laser 1 image" mode) avec les paramètres suivants: excitation 473 nm, filtre de détection LPB (510 nm), la résolution de 50 microns, la graduation du signal 16 bits, 400 V. CH1 (Scan prend environ 15-20 min par la membrane de taille 22 par 22 cm.)
   
   En option:
   
   
7. Laissez reposer pendant 2-4 heures (ou plus).
8. Répétez scanner comme à l'étape 6.

3. Le décapage et le stockage procédure (NUF version)

1. Transfert de membrane à 100% etHanol et incuber à température ambiante pendant 10 min avec agitation douce.
2. Remplacer avec de l'éthanol à 100% frais et incuber une nuit à température ambiante. (Membrane peut rester dans l'éthanol pendant plusieurs jours.)
3. Remplacer l'éthanol avec de l'eau distillée et incuber à température ambiante pendant 10 min.
4. Ajouter 100 ml d'eau et 5 ml de SDS à 10% (finale du SDS 0,5%) à un tube d'hybridation et mélanger doucement. Ajouter à membrane.
5. Incuber à 80 ° C pendant 1 h.
6. Transfert à membrane pour un récipient propre et vide.
7. Ajouter 500 ml d'eau et 5 ml de SDS à 10% (finale SDS 0,1%) un bécher et amener à ébullition vigoureuse dans le four à micro-ondes.
8. Verser la quasi-bouillante solution à 0,1% de SDS sur la membrane et agiter doucement pendant quelques minutes. Laisser refroidir à température ambiante.
9. Rincer à au moins 250 ml de solution stérile 100 mM de Tris pH 8 pendant au moins 10 min.
10. Envelopper dans la membrane SaranWrap et les bords soigneusement étroite avec des rubans. Conserver à 4 ° C. (Membranes ne doit jamais se dessécher.)

Discussion

La procédure de dépouillement n'a pas été optimisée. Toutefois, la procédure de décapage donné dans les instructions du fabricant (2 lavages chacun, 10 min dans de l'éthanol à 100%, 1 lavage de 1 h à 60 ° C dans du SDS 0,5%) est insuffisant. Au moins une nuit d'incubation dans de l'éthanol à 100% est nécessaire pour dissoudre le produit de la réaction ECF, plusieurs jours d'incubation dans de l'éthanol à 100% ne semble pas avoir d'effets néfastes sur l'aptitude à reprobe la membrane. Le fabricant du traitement de la SDD semble également être insuffisante. NUF a essayé 1 h à 80 ° C avec 0,5% de SDS suivie d'un traitement avec près bouillir 0,1% de SDS avec succès. Tracy a montré qu'une fois de coulée plus avec presque bouillante SDS 0,1% est suffisante.

Conseils utiles:
Le tampon d'hybridation, tube d'hybridation, et le tampon de lavage primaire doit être préchauffé à 60 ° C avant utilisation, et doit être maintenu à cette température durant l'expérience. Par exemple, garder les tampons sur une plaque chauffante avec un thermomètre plongé; sur une plaque chauffante Corning, un réglage d'environ 3 résultats à 60 ° C.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
AlkPhos Direct Labelling Reagents	kit	Amersham	RPN3680	Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C.
ECF Substrate	kit	Amersham	RPN3685	Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer.Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm).
20x Secondary Wash Buffer	buffer			121 g Tris(final 1 M), 117 g NaCl(final 2 M).Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months.
0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7	buffer			69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature.
1 M MgCl2				50.8 g MgCl2.6H2OAdjust to 250 ml with water. Store at room temperature.
10% (w/v) SDS				20 g SDSAdjust to 200 ml with water. Store at room temperatur
Combination pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685