Su larga scala Schermi di librerie metagenomiche

Abstract

Metagenomica frammenti di archiviare librerie di grandi dimensioni contigue sequenze genomiche da microrganismi senza la necessità di coltivazione precedente. Generazione di una procedura semplificata per la creazione e lo screening librerie metagenomiche è quindi utile per una efficiente high-throughput indagini sulle proprietà genetiche e metaboliche di assemblaggi microbica incolti. Qui, i protocolli chiave sono presentati in video, che vi proponiamo è il formato più utile per descrivere con precisione un lungo processo che dipende alternativamente sulla strumentazione robotica e (umano) interventi manuali. In primo luogo, abbiamo impiegato robotica di individuare cloni biblioteca su membrane ad alta densità macroarray, ognuno dei quali può contenere colonie duplicati da ventiquattro tavole biblioteca da 384 pozzetti. L'automazione è fondamentale per questa procedura non solo per precisione e velocità, ma anche per la miniaturizzazione di scala necessarie per montare il gran numero di cloni biblioteca accordi spaziali ad alta densità. Una volta generato, siamo prossimi dimostrato come le membrane macroarray possono essere sottoposti a screening per geni di interesse utilizzando versioni modificate di protocolli standard per l'etichettatura della sonda, l'ibridazione della membrana, e la rilevazione del segnale. Abbiamo completato la dimostrazione visiva di queste procedure, con dettagliate descrizioni scritte delle fasi coinvolte ed i materiali necessari, che sono tutti disponibili online a fianco del video.

Protocollo

1. Ibridazione procedura

Un tubo di ibridazione sono necessari 1 o 2 membrane (taglia 22 per 22 cm). Utilizzare 50 ml di miscela di ibridazione e 0,5 mg di DNA sonda (10 ng / ml concentrazione finale) per tubo ibridazione. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare gel purificato DNA come sonda. Se scaling up preparazione della sonda, aumentare il numero di tubi, piuttosto che aumentando la quantità di reagenti per provetta.

Sonda preparazione (0,5 mg DNA):

1. Diluire 15 ml di cross-linker soluzione con 60 ml di acqua.
2. Diluire il DNA a 10 ng / mL con acqua a 50 microlitri di volume totale in ....

Discussione

La procedura di stripping non è stato ottimizzato. Tuttavia, la procedura di stripping dato nelle istruzioni del produttore (2 lavaggi ciascuno, 10 minuti in 100% di etanolo, 1 lavaggio di 1 ora a 60 ° C a 0,5% SDS) è insufficiente. Almeno notte di incubazione in etanolo al 100% è necessario per sciogliere il prodotto di reazione ECF; diversi giorni di incubazione in 100% di etanolo non sembra avere effetti negativi sulla capacità di reprobe la membrana. Trattamento SDS del produttore sembra essere insufficiente. NUF ha provato 1 ora a 80 °.......

Materiali

Combinazione pacco RPN3692 = RPN3680 + RPN3685