Biology

メタゲノムライブラリの大規模スクリーン

Published: May 28, 2007 doi: 10.3791/201

Vinh D. Pham¹, Tsultrim Palden¹, Edward F. DeLong¹

¹Division of Biological Engineering, Department of Civil and Environmental Engineering, MIT - Massachusetts Institute of Technology

Summary

Abstract

前の栽培を必要とせずに微生物から連続したゲノム配列のメタゲノムライブラリのアーカイブ大きい断片。メタゲノムライブラリーを作成し、スクリーニングするための合理化された手順を生成すると、未培養微生物群集の遺伝的および代謝特性に効率的な高スループットの調査に有用である。ここでは、主要なプロトコルは、我々は正確に交互にロボットの計測と（人間の）手動の介入に依存する長いプロセスを記述するための最も有用なフォーマットである提案するビデオ、上に表示されています。最初に、我々は、24 384ライブラリのプレートから重複したコロニーを含むことができるそれぞれの高密度マクロアレイメンブレン上にライブラリークローンを、見つけるためにロボットを採用。オートメーションは、高密度の空間的配置にライブラリークローンの大規模な数に合わせて必要な規模の小型化のためだけでなく、精度と速度のため、この手順が不可欠ですが、。一度生成された、我々は次のマクロアレイメンブレンは、プローブのラベリング、メンブレンハイブリダイゼーション、およびシグナル検出のための標準プロトコルの修正バージョンを使用して、目的の遺伝子をスクリーニングすることができる方法を示しました。我々は、ビデオと一緒にオンラインで利用可能なすべてが詳細に書かれた必要な手順の説明と必要な材料、これらの手順の視覚的なデモンストレーションを補完。

Protocol

1。ハイブリダイゼーションの手順

ワンハイブリダイゼーションチューブは、1または2膜（22 cmの大きさ22）がかかります。ハイブリダイゼーション混合物を50mlとハイブリダイゼーションチューブあたりのDNAプローブ（10 ng / mlの最終濃度）の0.5mgを使用してください。最良の結果を得るには、プローブとしてゲル精製したDNAを使用してください。プローブ調製スケールアップした場合、チューブの数ではなく、チューブあたり試薬の量を増やすことを増やす。

プローブ調製（0.5mgのDNA）：

水60μlで架橋剤溶液15μlを希釈する。
スクリューキャップチューブに50μlの合計容積に水では10 ng /μlにDNAを希釈する。
沸騰したお湯で5分間変性されたDNA。
急速に氷に転送し、5分間冷ます。簡単にスピン。
反応緩衝液50μlを加え、穏やかに混ぜる。
標識試薬10μlを加え、穏やかに混ぜる。
ステップ1から希釈架橋剤溶液50μlを加え、穏やかに混ぜる。穏やかに攪拌し、簡単にスピン。
37℃で30分間インキュベートします。
最大2時間まで氷上で維持するか、-20℃で100％のグリセロールとストアの等量を追加する

注：キットに付属の水を使用してください。特に断りのない限り氷上のすべての試薬を保管してください。

膜調製とハイブリダイゼーション

ハイブリダイゼーション緩衝液とハイブリダイゼーションチューブ60への予熱50ミリリットル℃に
ハイブリダイゼーションチューブにハイブリダイゼーションバッファーを追加します。膜（s）をロールアップするとハイブリダイゼーションチューブに加える。（チューブあたり2膜、完全に一つの膜上最初のロールを追加する場合は、同じ方向に上に他の膜をロールアップします。）
60℃のハイブリダイゼーションチューブをインキュベート℃で少なくとも半時間のためのCを（膜（s）が全身ずぶぬれになることを確認してください。）
ハイブリダイゼーションチューブから標識プローブを含むチューブに長いピペットでハイブリダイゼーション緩衝液約1mlを転送します。穏やかに攪拌し、簡単にスピン。ハイブリダイゼーションチューブに戻って混合物を移す。
60℃で一晩。

注：使用鉗子と手袋膜を処理する。あまりにも多くの攪拌は望ましくない泡の永続的な形成の原因となるので、ゆっくりとハイブリダイゼーションチューブのコンテンツを混ぜる。膜は湿潤状態で追加する必要があります。追加する前に、必要に応じて、ハイブリダイゼーション緩衝液または水に浸すと余分な水分を切る。

2。検出の手順

洗濯膜

60℃に予熱一次洗浄バッファー（電子レンジ及び/または加熱プレートを使用してください。）
oneハイブリダイゼーションチューブ2膜がある場合は、きれいに、予熱、空のハイブリダイゼーションチューブに一つの膜を転送する。
簡単に言えば一次洗浄バッファーの約50 mlのハイブリダイゼーションチューブをリンス。
60ハイブリダイゼーションチューブとインキュベートする一次洗浄バッファーの約100 mlを加え℃で10分間。
ステップ3と4を繰り返します。
5分間室温で二次洗浄バッファーの少なくとも250mlの容器とインキュベートし、洗浄するために膜を移し。
手順6を繰り返します。

注：膜が信号生成の前に½時間まで室温で二次洗浄バッファーに保持されることがあります。

信号発生と検出（一つの膜のための手順）

卓上へSaranWrapフラットのテープ2個（ステップ2の1つ、ステップ4のいずれか）。
慎重に容器の側面に膜の角に触れることにより膜から余分なバッファを切るとSaranWrap（最大試料側）にメンブレンを転送する。
膜上の膜と倍サランのラップ上ECF試薬6〜7 mlを注ぐ。慎重にゆっくりとSaranWrap以上キムワイプを移動することによって、細胞膜上のECFの試薬を販売しています。 5分間インキュベートする。
メンブレンから過剰なECFの試薬を切ると新しいSaranWrap、膜上の倍のラップの上にそれを転送し、テープで縁をシール。アルミ箔をメンブレンにかぶせ。 1-2時間インキュベートする。
ガラス板の上にECFの試薬の1〜2 mlを分散することにより、スキャナのガラス板を準備します。その後、ガラス板上に膜を転送する（下にサンプル側）と膜上のECFの試薬の別の1〜2ミリリットルを配布する。 SaranWrapとオーバーレイと慎重に離れて膜からすべての気泡を押してください。（これは、ガラス板に押し付け膜を維持するためにSaranWrapの上に硬い板を置くことができます。）
検出フィルタLPB（510 nm）を、分解能は50μm、16ビットの信号を卒業、CH1 400 V.（スキャン、励起473 nmの：次の設定で富士FLA - 5100蛍光スキャナー（"1レーザ1のイメージ"モード）を使用してください22センチメートルでサイズ22の膜あたり約15〜20分かかります。）

省略可能：
2〜4時間（以上）放置します。
手順6のようにスキャンする手順を繰り返します。

3。手順（NUF版）をストリッピングして保存

100％に膜を移しら穏やかに振盪しながら10分間室温でhanolとインキュベート。
新鮮な100％エタノールで置き換えると、室温で一晩インキュベートする。（メンブレンは数日間エタノールに残っていることがあります。）
蒸留水でエタノールを交換し、10分間室温でインキュベートする。
ハイブリダイゼーションチューブを100 mlの水と10％SDS（最後の0.5％SDS）を5mlを加え、穏やかに混ぜる。メンブレンを追加。
80℃1時間インキュベート
きれいな、空の容器にメンブレンを移し。
SDS（最後の0.1％SDS）電子レンジでの活発な沸騰にビーカーと熱水500mlを加え、10％の5 mlです。
膜上にほぼ沸騰0.1％SDS溶液を注ぎ、軽く数分間振とうする。室温に冷却してください。
少なくとも10分間滅菌100mMトリスpHを8の少なくとも250 mlでリンス。
SaranWrapの膜とテープで慎重に近いエッジを包みます。 4℃で保存します。（膜が完全に乾くことはない必要があります。）

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Discussion

ストリッピングの手順が最適化されていません。しかし、メーカーの指示（2回洗浄それぞれ、100％エタノールで10分間、60℃0.5％SDSで1時間の1洗浄）で与えられるストリッピングの手順は不十分です。 100％エタノールで少なくとも一晩のインキュベーションでは、ECFの反応生成物を溶解するために必要であり、100％エタノールで数日のインキュベーションでは、メンブレンをリプローブする能力に悪影響がないように見えることがあります。メーカーのSDS処理も不十分なように見えます。 NUFは80℃1時間をしようとした° C、0.5％SDSが成功とほぼ沸騰0.1％SDSで一つの治療が続くと。トレイシーは、一度はほぼ沸騰0.1％SDSでオーバー注ぐことが十分であることが示されている。

役立つヒント：
ハイブリダイゼーション緩衝液、ハイブリダイゼーションチューブ、および一次洗浄バッファーを60に予熱する必要があります° C使用前に、実験を通してその温度に保たれている必要があります。例えば、浸漬温度計で加熱板上でバッファを保つ;コーニングの加熱プレート上に、約3結果の設定値を60で℃の

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Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
AlkPhos Direct Labelling Reagents	kit	Amersham	RPN3680	Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C.
ECF Substrate	kit	Amersham	RPN3685	Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer.Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm).
20x Secondary Wash Buffer	buffer			121 g Tris(final 1 M), 117 g NaCl(final 2 M).Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months.
0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7	buffer			69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature.
1 M MgCl2				50.8 g MgCl2.6H2OAdjust to 250 ml with water. Store at room temperature.
10% (w/v) SDS				20 g SDSAdjust to 200 ml with water. Store at room temperatur
Combination pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685