Summary
Abstract
Метагеномных архива библиотеки крупных фрагментов смежных геномных последовательностей из микроорганизмов, не требуя предварительного культивирования. Создание упрощенной процедуре для создания и проверки метагеномных библиотек поэтому полезен для эффективного высокопроизводительного расследования генетических и метаболических свойств некультурных комплексов микроорганизмов. Здесь основные протоколы представлены на видео, которое мы предлагаем, является наиболее полезным форматом для точного описания длительный процесс, который попеременно зависит от роботов приборов и (человеческого) вмешательства руководства. Во-первых, мы использовали робототехники обнаружить библиотеку клонов на высокой плотности мембран macroarray, каждый из которых может содержать повторяющиеся колоний от двадцати четырех 384-луночных библиотеки. Автоматизация имеет важное значение для этой процедуры не только точность и скорость, но и за счет миниатюризации масштабах, необходимых, чтобы соответствовать большое количество клонов в библиотеке высокой плотности пространственных механизмов. После генерируется, мы в следующий раз продемонстрировал, как macroarray мембраны могут пройти обследование на гены интереса с использованием модифицированной версии стандартных протоколов для зонда маркировки, мембранные гибридизация и обнаружения сигнала. Мы дополняли наглядной демонстрации этих процедур с подробного письменного описания этапов и материалов, необходимых, все из которых доступны в Интернете вместе с видео.
Protocol
1. Гибридизация процедуры
Один гибридизации трубка будет принимать по 1 или 2 мембраны (размер 22 на 22 см). Используйте 50 мл гибридизации смеси и 0,5 мг ДНК-зонда (10 нг / мл, конечная концентрация) в гибридизации трубки. Для достижения наилучших результатов, используйте гель-очищенной ДНК в качестве зонда. Если расширение масштабов подготовки зонда, увеличение количества трубок, а не увеличения количества реагентов в трубке.
Зонд подготовки (0,5 мг ДНК):
- Развести 15 мкл поперечных связей решение с 60 мкл воды.
- Развести ДНК до 10 нг / мкл водой до 50 мкл общего объема в винт крышками микропробирок.
- Денатурации ДНК в течение 5 минут в кипящую воду.
- Быстро передавайте в лед и дайте остыть в течение 5 мин. Спиновые кратко.
- Добавить 50 мкл реакционного буфера и аккуратно перемешать.
- Добавьте 10 мкл реагента маркировки и аккуратно перемешать.
- Добавить 50 мкл разбавленного поперечных связей решение с шага 1 и аккуратно перемешать. Vortex мягко и спина кратко.
- Инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин.
- Держите на льду в течение до 2 ч или добавить равный объем 100% глицерина и хранить при температуре -20 ° C.
Примечание: Использование воды, поставляемой в комплекте. Храните все реагенты на льду, если не указано иное.
Мембранные подготовки и гибридизации
- Разогрейте 50 мл буфера гибридизации и гибридизации трубки до 60 ° C.
- Добавить гибридизации буфера для гибридизации трубки. Свернуть мембраны (ов) и добавить к гибридизации трубки. (Если добавить 2 мембраны в трубку, сначала свернуть одной мембраны полностью, затем сверните другие мембраны на первое место в том же направлении.)
- Инкубируйте гибридизации трубке при 60 ° С не менее ½ ч. (Удостоверьтесь, что мембрана (ы) промокнуть основательно.)
- Передача около 1 мл буфера гибридизации с длинной пипеткой от гибридизации трубки в пробирку меченым зондом. Vortex мягко и спина кратко. Передача смесь обратно в гибридизации трубки.
- Инкубировать при 60 ° С в течение ночи.
Примечание: Используйте пинцет и перчатки при работе с оболочкой. Смешайте содержание гибридизации трубы аккуратно, потому что слишком много агитация вызовет постоянного образования нежелательных пены. Мембраны должны быть добавлены в мокром состоянии, замочить в буфер гибридизации или воды в случае необходимости и стечь лишней жидкости перед добавлением.
2. Определение процедуры
Стиральная мембран
- Разогреть первичного буфера стиральную до 60 ° C. (Используйте микроволновую печь и / или нагревательного элемента.)
- Если Есть две мембраны в одном гибридизации трубки, передача одной мембраны на чистую, разогретую, пустые трубки гибридизации.
- Кратко промыть гибридизации трубки около 50 мл первичной промывочным буфером.
- Добавить 100 мл первичной промывочный буфер в трубку гибридизации и инкубировать при температуре 60 ° С в течение 10 мин.
- Повторите шаг 3 и 4.
- Передача мембраны для мытья тары и инкубировать, по крайней мере 250 мл вторичный буфер стирка при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Повторите шаг 6.
Примечание: Мембраны могут быть оставлены на вторичном буфере стирка при комнатной температуре в течение до ½ часа до генерации сигнала.
Поколения и обнаружения сигнала (процедура для одной мембраны)
- Лента двух кусков плоских SaranWrap на настольные (по одному на шаге 2 и по одному на шаге 4).
- Тщательно отвода избыточного буфер из мембраны, касаясь углов мембраны к стенке контейнера и передачи мембраны на SaranWrap (образец вверх).
- Залить 6-7 мл ECF реагента над мембраной и раз Саран запахом мембраны. Тщательно распространять ECF реагента над мембраны, мягко движущихся Kimwipe более SaranWrap. Инкубировать в течение 5 мин.
- Слить избыток реагента ECF от мембраны и передача его на новый SaranWrap, сложите запахом мембраны и уплотнения краев ленты. Обложка мембрана с алюминиевой фольгой. Инкубируйте в течение 1-2 часов.
- Подготовка пластин стекла сканера, распределяя 1-2 мл ECF реагента над стеклянной пластиной. Затем перенесите мембраны на стеклянную пластину (образец стороной вниз) и распространять еще 1-2 мл реагента ECF над мембраной. Наложение с SaranWrap и осторожно подтолкнуть все пузырьки воздуха в сторону от мембраны. (Вы можете разместить жесткой пластины сверху SaranWrap держать мембрана прижимается к стеклянной пластинке.)
- Используйте Fuji FLA-5100 флуоресценции сканер ("1 лазер 1 изображение" режим) со следующими параметрами: возбуждение 473 нм, обнаружение фильтр LPB (510 нм), разрешение 50 мкм, 16-битный сигнал окончания CH1 400 В. (сканирование занимает около 15-20 мин на оболочку размером 22 на 22 см).
Дополнительно: - Дайте настояться в течение 2-4 часов (или дольше).
- Повторите сканирование как в шаге 6.
3. Зачистка и хранения процедуры (Нуф версия)
- Передача мембраны до 100% и др.hanol и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин при легком помешивании.
- Замените свежие 100% этилового спирта и выдержать в течение ночи при комнатной температуре. (Мембрана может оставаться в этаноле в течение нескольких дней.)
- Замените этанола с дистиллированной водой и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Добавить 100 мл воды и 5 мл 10% SDS (последние 0,5% SDS) для гибридизации трубки и аккуратно перемешать. Добавить мембраны.
- Инкубировать при 80 ° С в течение 1 ч.
- Передача мембраны чистый, пустой контейнер.
- Добавить 500 мл воды и 5 мл 10% SDS (окончательный 0,1% SDS) стакан и тепло энергичный варить в микроволновой печи.
- Налейте кипящую почти 0,1% SDS решением над мембраной и мягко агитировать за несколько минут. Дать остыть до комнатной температуры.
- Полоскание в по меньшей мере 250 мл стерильного 100 мМ Трис рН 8, по крайней мере 10 мин.
- Оберните мембраны в SaranWrap и тщательно близко краям ленты. Хранить при температуре 4 ° С. (Мембраны никогда не должна высыхать.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Зачистки процедура не была оптимизирована. Тем не менее, зачистки процедурой, приведенной в инструкции производителя (2 моет каждый, 10 мин в 100% этанол, 1 мыть 1 ч при 60 ° С в 0,5% SDS) является недостаточной. По крайней мере инкубации в течение ночи в 100% этанола необходимо растворить продукт ECF реакции; несколько дней инкубации в 100% этилового спирта, похоже, не оказывают негативного влияния на способность reprobe мембраны. SDS лечения производителя также, кажется, недостаточно. Нуф пытался 1 ч при 80 ° C с 0,5% SDS следуют одна лечения с почти кипящей 0,1% SDS успехом. Трейси показал, что одно время заливки более с почти кипящей 0,1% SDS достаточно.
Полезные советы:
Гибридизации буфер, гибридизация трубки, и первичные промывочный буфер должен быть предварительно нагретую до 60 ° С до использования, и должна храниться при этой температуре в течение всего эксперимента. Например, держать буферов на плитке с погруженными термометр; на тарелку Corning отопления, установка около 3 результаты в 60 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| AlkPhos Direct Labelling Reagents | kit | Amersham | RPN3680 | Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C. |
| ECF Substrate | kit | Amersham | RPN3685 | Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer.Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm). |
| 20x Secondary Wash Buffer | buffer | 121 g Tris(final 1 M), 117 g NaCl(final 2 M).Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months. | ||
| 0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 | buffer | 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature. | ||
| 1 M MgCl2 | 50.8 g MgCl2.6H2OAdjust to 250 ml with water. Store at room temperature. | |||
| 10% (w/v) SDS | 20 g SDSAdjust to 200 ml with water. Store at room temperatur | |||
| Combination pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685 | ||||
