Overview
Drosophila flygmuskler används som ett modellsystem för muskelutveckling och fysiologi. Denna video beskriver flygmuskulaturen hos vuxna och belyser ett protokoll för att dissekera utveckla indirekta flygmuskler som är lämpliga för RNA-sekvensering från puppar.
Protocol
Detta protokoll är ett utdrag från Kao et al., Dissekering av Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches, J. Vis. Exp. (2019).
1. IFM Dissekering efter 48 h APF
- Montera nödvändig utrustning inklusive två #5 biologiklass tång, fin sax, standardglasmikroskoprutschbanor, dubbelstickstejp, pipett, pipettspetsar, torris och (för RNA-applikationer) isoleringsreagens (se Materialförteckning). Kyl 1x PBS och mikrocentrifugrören på is.
- Använd en lätt våt pensel och överför de iscensatta pupparna till en remsa av dubbelsidig klistertejp monterad på en mikroskopbild (Figur 1A). Placera popparna i en linje, orienterad i samma orientering (ventral nedåt och främre mot bildens botten).
OBS: Var försiktig så att du inte använder för mycket vatten på penseln eller filtret, annars fastnar inte popparna bra. Om puppor inte fastnar, torka dem genom att först överföra till ett torrt filter eller vävnadspapper. Montera så många puppar som kan dissekeras inom ett 30 minuters tidsfönster, helst ~ 10 puppar. - Ta bort poppan från poppväskan. Använd tång för att reta isär och öppna pupalfallet ovanför de främre spiraclesna (Figur 1B).
- Skjut försiktigt ett par tångar dorsally mot den bakre, skär poppväskan när tången rör sig (Figur 1B '). Var försiktig så att du inte bryter den underliggande poppan. Befria poppan från det öppnade fodralet och överför den omedelbart till en droppe 1x PBS på en andra mikroskopbild(bild 1B",C).
- Upprepa steg 1.3 och 1.4 för alla puppar i kön och ställ sedan dubbelstickstejpen åt sidan.
- Använd den fina saxen och skär bort poppans buk från bröstkorgen och tryck in den i en separat hög(figur 1D,D). Upprepa för de återstående pupparna.
OBS: Börja tajma dissekeringslängden med steg 1.6, så snart pupalintegriteten störs. Dissekera så många flugor som möjligt på 20–30 minuter för att förhindra celldöd och tillhörande transkriptomiska och proteomiska förändringar. Vid dissekering av 1 d vuxna eller >90 h puppar är det ofta bekvämt för senare steg att dessutom ta bort huvudet med den fina saxen. - Använd ett mjukpapper, ta bort majoriteten av 1x PBS (i allmänhet grumligt med suspenderat fett) samt högen med buken (Figur 1E). Tillsätt en droppe färsk, kyld 1x PBS till de återstående bröstkorgarna.
- Använd saxen för att skära bröstkorgen i hälften (figur 1F,F ') genom att skära från huvudet ner längs den längsgående kroppsaxeln i en enda rörelse. Alternativt, om huvudet har tagits bort, sätt först in saxen där huvudet fästes och skär den övre halvan av bröstkorgen längsgående mellan IFMs. Skär sedan bröstkorgens ventrala sida med ett andra snitt i samma orientering.
- Upprepa steg 1.7 och 1.8 för att alla puppar ska dissekeras, vilket genererar en hög med bröstkorgsvalisections nära mitten av bilden. Se till att det finns tillräckligt med kyld 1x PBS på bilden så att hemisectionsna inte torkar ut.
OBS: Efter 48 h APF är IFMs tillräckligt stora för att vara synliga under ett standard dissekeringsmikroskop till det tränade ögat. Vid denna tidpunkt i protokollet kan muskler med en fluorescerande etikett flyttas till en fluorescerande dissekeringsutrymme för att hjälpa till med IFM-identifiering eller för träningsändamål, men det är inte nödvändigt. - Dissekera IFMs ur bröstkorgen. Isolera en av hemisectionsna med #5 tång(figur 1G,H). Sätt försiktigt in spetsarna på en tång ovanför och under mitten av IFMs(figur 1G',H). Medan du håller de första tångarna stilla, använd fin sax för att skära ena änden av IFM bort från nagelband och senor. Skär sedan den andra änden av IFM fri från nagelbandet(figur 1G'', H').
OBS: Beroende på bröstkorgens orientering efter den första IFM-skärningen är det användbart att rotera bröstkorgen 180° så att den andra IFM-skärningen är lättare att utföra. - Ta bort IFM-bunten från bröstkorgen med tång (figur 1G''', H''), överför den till kanten av PBS-bubblan för att använda vattenspänning för att hålla den på plats (figur 1I). Tryck slaktkroppen mot motsatt sida av rutschkanan. Upprepa för de återstående bröstkorgens hemisections, vilket genererar en samling dissekerade IFMs.
OBS: Om IFMs inte stannar i en snygg hög, ta bort en del av 1x PBS med en vävnad. Var försiktig så att du inte låter alla PBS avdunsta och se till att de dissekerade IFMs och hemithoraxes förblir täckta av buffert. - Efter dissekering av alla IFMs, utför snabbt en kvalitetskontroll på den dissekerade muskeln. Använd #5 tång, ta bort eventuella hoppmuskel- eller nagelbandsfragment som kan ha hittat in i provet(figur 1J-K').
OBS: Hoppmuskeln verkar annorlunda än IFM. Om dissekera Mef2-Gal4 märkt muskel under fluorescens, hoppa muskel har en svagare fluorescens och en annan form och textur. Under normalt ljus verkar det nästan genomskinligt medan IFMs är en ogenomskinlig, mjölkgul(figur 1J-J',K). - Använd vattenspänning, fånga (men krossa inte) de dissekerade IFMs mellan ett par tångar (Figur 1L). Överför IFMs till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör förfyllt med 250 μL kylt 1x PBS(figur 1M). Fortsätt omedelbart med avsnitt 2.
OBS: När tångspetsar förs in i närheten av varandra och lyfts ut ur en buffertlösning, orsakar vattenspänning en bubbla av buffert som fångas mellan tångspetsarna. Om IFMs också finns i denna bubbla kan de lyftas ur lösningen och enkelt överföras till ett annat buffertfyllt uttag. Det är viktigt att pressa tången för att få spetsarna nära varandra utan att röra varandra, för att undvika att macerating vävnaden fångas i buffertbubblan.
2. Pellet och bevara IFM-provet
- Pellet IFMs genom att centrifugera 1,5 ml mikrocentrifugrör i 3–5 min vid 2 000 x g i en centrifug med bordsskiva (figur 2A,B).
- Ta bort bufferten med en pipettspets (Bild 2C).
- För RNA-tillämpningar, återanvänd IFM-pelleten i 50–100 μL av önskad RNA-isoleringsbuffert (se Materialförteckning, figur 2D). Fortsätt annars till steg 2.4.
OBS: IFMs kan torrfrysas efter steg 2.2 för masspektrometripreparat eller isolering av RNA med kommersiella satser (se representativa resultat). För RNA-tillämpningar erhålls bättre resultat genom att omedelbart återanvända och frysa IFM-pelleten i isoleringsbuffert. - Frys provet på torris eller knäpp frys i flytande kväve (figur 2E). Förvara vid -80 °C tills den är klar för efterföljande steg i provberedningen för analys nedströms.
OBS: Efter kryopreservation kan prover lagras i flera månader före bearbetning för nedströms undersökning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1: Dissekering av IFMs efter 48 h APF. A)Justering av puppar på dubbelstickstejp. b)Avlägsnande av puppor från poppväskan genom att öppna främre, skära fallet dorsalt(B') och lyfta ut poppan (B'). Cirkelsymboler representerade samma som figur 2. C)Överföring av puppar till buffert. D)Avlägsnande av buken genom skärning med sax (gula dubbelpilar) och separation från bröstkorgar (D '). (E,F) Tillsats av renbuffert ( E), sedan skärning av bröstkorgar i hälften längsgående(F,F'). (G,H) Dissekeringar kan utföras under vitt ljus (G) eller fluorescens för att visualisera GFP (H); Styckning av IFMs på ena sidan (G '), därefter den andra sidan (G'). lyfta ut ur bröstkorgen med tång (skisserat i grått) (G''). -Jag, J, K. Insamling av IFMs i buffert (I) och avlägsnande av förorenande ventral nerv sladd (VNC), tarm och hopp muskel (TDT) (J) för att generera ett rent IFM prov (K). TDT har lägre GFP-uttryck och en annan form än IFM-fibrer (J'', K'). Jagär ledsen, men jag har inte tid med dethär Användning av tång för att överföra IFMs(L)till ett mikrocentrifugrör (M). Skalstänger = 1 cm (A,E,M), 1 mm (B-D',F-L). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: INFORMATION OM IFM-bevarande och RNA-isolering. A)IFMs pelleteras genom centrifugering i 5 min vid 2000 x g. B)IFM-pellets (pil) och pellets under fluorescens (B'). C)Avlägsnande av all buffert med pipettspets. D)För RNA-extraktion, återsuspension av pellets i isoleringsbuffert. Det här steget kan hoppas över till torrfrysning dissekerade IFMs. e)Frysning av provet i flytande kväve eller på torris och lagring vid -80 °C. Skalstänger = 10 cm (A), 1 mm (B,B),1 cm (C,D,E). (F) Nanogram (ng) av totalt RNA från dissekerad IFM erhålls per fluga vid 16 h APF, 24 h APF, 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF, 90 h APF och 1 d vuxen. Felstaplar = SD. (G) Totalt RNA isolerat från IFM dissekerat från 50 1 d vuxna flugor med olika extraktionsmetoder. Felstaplar = SD. (H) Representativa spår för att analysera RNA-integritet efter olika extraktionsmetoder. Ribosombanden går strax under 2000 nukleotider (nt) och markörbandet på 25 nt. Ytterligare spår finns i kompletterande figur 1. (I) Representativa spår av ett nyligen isolerat RNA-prov (överst), ett prov fryst 25x på torris (andra tomten), ett prov kvar i 4 timmar på bänken (tredje tomten) och ett prov behandlat med RNase A (nedre tomten). Observera fullständig nedbrytning av RNA vid tillsats av RNase A. (J) RT-PCR gel från satser märkta för bru1 och rp49. Den relativa intensiteten i bru1-bandet som normaliserats mot rp49 plottas nedan. Felstaplar = SEM (unpaired t-test, p = 0,0119). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1. A,B,C) RNA ger resultat från prover av samma genotyp dissekerade av samma forskare samma vecka. Efter att alla prover dissekerats isolerades RNA och mättes samma dag. A)Nanogram (ng) av totalt RNA som erhållits från IFM-dissekeringar per 1 d vuxenfluga. Felstaplar = SEM. (B) Totalt RNA erhållet från dissekerad IFM per fluga vid 30 h APF, 48 h APF, 72 h APF och 1 d vuxen. (C) Totalt RNA isolerat från IFM dissekerat från 50 1 d vuxna flugor med olika extraktionsmetoder. D)Totala RNA-koncentrationer per fluga från dissekerade ben, hoppmuskel (TDT) och IFM. Mer RNA erhålls från de större IFMs. Felstaplar = SD. (E) Totala RNA-koncentrationer per fluga av IFM dissekerade från kontroller jämfört med RNAi eller mutantprover vid 30 h APF, 72 h APF och 1 d vuxen. För mutanter användes w1118 som vildtypskontroll. Mutantdata sammanställs från bru1-IR, salm-/- och en annan RNA-bindande proteinmutant. Observera att för dessa manipuleringar minskar RNA-utbyten hos 1 d vuxna på grund av muskelatrofi och förlust, så fler flugor måste dissekeras för att erhålla tillräckliga mängder för omikmetoder. Felstaplar = SD. (F) Ytterligare spår som visar RNA-integriteten för de RNA-isoleringsmetoder som visas i figur 2G och i C. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Z643084-600EA | Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented |
| Cell phone camera, Samsung Galaxy S9 | Samsung | SM-G960F/DS | used for photos not taken under a microscope |
| Double stick tape | Scotch/3M | 3M ID 70005108587 | Double-sided tape, available at most office supply handlers |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 mm x 0.02 mm tip |
| fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0 | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC | Leica | www.leica-microsystems.com | |
| Fly: Bru1[M2] | Fly stock; This paper | ||
| Fly: Bru1[M3] | Fly stock; This paper | ||
| Fly: Mef2-GAL4 | Bloomington Stock Center | BDSC:27390 | Fly stock |
| Fly: salm[1] | Bloomington Stock Center | 3274 | Fly stock |
| Fly: salm[FRT] | Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018 | ||
| Fly: UAS-Bru1IR | Vienna Drosophila Research Center | GD41568 | Fly stock, RNAi hairpin |
| Fly: UAS-GFP::Gma | Bloomington Stock Center | BDSC:31776 | Fly stock |
| Fly: UAS-mCD8a::GFP | Bloomington Stock Center | BDSC:5130 | Fly stock |
| Fly: w[1118] | Bloomington Stock Center | 3605 | Fly stock |
| Fly: weeP26 | Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003 | ||
| GFP detection reagent, GFP-Booster | ChromoTek | gba488-100 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | |
| Image processing software, Photoshop CS6 | Adobe | www.adobe.com | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | 2-propanol |
| Method 1 (RNA isolation): TRIzol | Life Technologies | 15596018 | Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution |
| Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit | Invitrogen | AM1907 | TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA |
| Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit | Zymo Research | R2070S | RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer. |
| Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues. |
| Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System | Promega | Z6110 | We applied the protocol for 'Purification of RNA from Fibrous Tissues'. |
| Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England Biolabs | T2010G | We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 µL of RNA Protection Reagent. |
| Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher | AM12400 | RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 12342108 | Standard slides, uncharged, 1 mm |
| Paintbrush | Marabu | 1910000000 | Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS buffer (1x) | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4 |
| PFA PureTip Pipette Tips | Elemental Scientific | ES-7000-0101 | Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice |
| Pipette tips | Sigma-Aldrich | P5161 | Universal 200 mL pipette tips |
| RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| RNA concentration Approach 2, Nanodrop | Thermo Fisher | ND-2000 | |
| RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | |
| RNase A | Promega | A7937 | |
| RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase. |
| RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit | Invitrogen | 18080-044 | reverse transcription kit |
| RT Kit #2: LunaScript | New England Biolabs | E3010S | reverse transcription kit |
| RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205410 | reverse transcription kit |
| Statistical software: GraphPad Prism | GraphPad Prism | www.graphpad.com | |
| Statistical software: Microscoft Excel | Microsoft | Purchased as part of the bundle: Office Home & Student 2019 | |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5405000760 | Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent |
| Tissue/ Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Standard tissue wipes |
| Transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z350796 | Plastic pipette |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | 3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm |
| Whatman paper | Sigma-Aldrich | 1004-070 | Filter paper circles, Grade 4, 70 mm |
