Drosophila (olika betydelser) Sen pupa indirekt flygmuskel (IFM) dissekering: En metod för hög genomströmningsvävnadsinsamling

Abstract

Källa: Kao, S. Y., et al. Dissekering av Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches. J. Vis. Exp. (2019).

Drosophila flygmuskler används som ett modellsystem för muskelutveckling och fysiologi. Denna video beskriver flygmuskulaturen hos vuxna och belyser ett protokoll för att dissekera utveckla indirekta flygmuskler som är lämpliga för RNA-sekvensering från puppar.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Kao et al., Dissekering av Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches, J. Vis. Exp. (2019).

1. IFM Dissekering efter 48 h APF

1. Montera nödvändig utrustning inklusive två #5 biologiklass tång, fin sax, standardglasmikroskoprutschbanor, dubbelstickstejp, pipett, pipettspetsar, torris och (för RNA-applikationer) isoleringsreagens (se Materialförteckning). Kyl 1x PBS och mikrocentrifugrören på is.
2. Använd en lätt våt pensel och överför de iscensatta pupparna till en remsa av dubbelsidig klistertejp monterad på en mikroskopbild (Figur 1A). Placera popparna i en linje, orienterad i samma orientering (ventral nedåt och främre mot bildens botten).
   OBS: Var försiktig så att du inte använder för mycket vatten på penseln eller filtret, annars fastnar inte popparna bra. Om puppor inte fastnar, torka dem genom att först överföra till ett torrt filter eller vävnadspapper. Montera så många puppar som kan dissekeras inom ett 30 minuters tidsfönster, helst ~ 10 puppar.
3. Ta bort poppan från poppväskan. Använd tång för att reta isär och öppna pupalfallet ovanför de främre spiraclesna (Figur 1B).
4. Skjut försiktigt ett par tångar dorsally mot den bakre, skär poppväskan när tången rör sig (Figur 1B '). Var försiktig så att du inte bryter den underliggande poppan. Befria poppan från det öppnade fodralet och överför den omedelbart till en droppe 1x PBS på en andra mikroskopbild(bild 1B",C).
5. Upprepa steg 1.3 och 1.4 för alla puppar i kön och ställ sedan dubbelstickstejpen åt sidan.
6. Använd den fina saxen och skär bort poppans buk från bröstkorgen och tryck in den i en separat hög(figur 1D,D). Upprepa för de återstående pupparna.
   OBS: Börja tajma dissekeringslängden med steg 1.6, så snart pupalintegriteten störs. Dissekera så många flugor som möjligt på 20–30 minuter för att förhindra celldöd och tillhörande transkriptomiska och proteomiska förändringar. Vid dissekering av 1 d vuxna eller >90 h puppar är det ofta bekvämt för senare steg att dessutom ta bort huvudet med den fina saxen.
7. Använd ett mjukpapper, ta bort majoriteten av 1x PBS (i allmänhet grumligt med suspenderat fett) samt högen med buken (Figur 1E). Tillsätt en droppe färsk, kyld 1x PBS till de återstående bröstkorgarna.
8. Använd saxen för att skära bröstkorgen i hälften (figur 1F,F ') genom att skära från huvudet ner längs den längsgående kroppsaxeln i en enda rörelse. Alternativt, om huvudet har tagits bort, sätt först in saxen där huvudet fästes och skär den övre halvan av bröstkorgen längsgående mellan IFMs. Skär sedan bröstkorgens ventrala sida med ett andra snitt i samma orientering.
9. Upprepa steg 1.7 och 1.8 för att alla puppar ska dissekeras, vilket genererar en hög med bröstkorgsvalisections nära mitten av bilden. Se till att det finns tillräckligt med kyld 1x PBS på bilden så att hemisectionsna inte torkar ut.
   OBS: Efter 48 h APF är IFMs tillräckligt stora för att vara synliga under ett standard dissekeringsmikroskop till det tränade ögat. Vid denna tidpunkt i protokollet kan muskler med en fluorescerande etikett flyttas till en fluorescerande dissekeringsutrymme för att hjälpa till med IFM-identifiering eller för träningsändamål, men det är inte nödvändigt.
10. Dissekera IFMs ur bröstkorgen. Isolera en av hemisectionsna med #5 tång(figur 1G,H). Sätt försiktigt in spetsarna på en tång ovanför och under mitten av IFMs(figur 1G',H). Medan du håller de första tångarna stilla, använd fin sax för att skära ena änden av IFM bort från nagelband och senor. Skär sedan den andra änden av IFM fri från nagelbandet(figur 1G'', H').
    OBS: Beroende på bröstkorgens orientering efter den första IFM-skärningen är det användbart att rotera bröstkorgen 180° så att den andra IFM-skärningen är lättare att utföra.
11. Ta bort IFM-bunten från bröstkorgen med tång (figur 1G''', H''), överför den till kanten av PBS-bubblan för att använda vattenspänning för att hålla den på plats (figur 1I). Tryck slaktkroppen mot motsatt sida av rutschkanan. Upprepa för de återstående bröstkorgens hemisections, vilket genererar en samling dissekerade IFMs.
    OBS: Om IFMs inte stannar i en snygg hög, ta bort en del av 1x PBS med en vävnad. Var försiktig så att du inte låter alla PBS avdunsta och se till att de dissekerade IFMs och hemithoraxes förblir täckta av buffert.
12. Efter dissekering av alla IFMs, utför snabbt en kvalitetskontroll på den dissekerade muskeln. Använd #5 tång, ta bort eventuella hoppmuskel- eller nagelbandsfragment som kan ha hittat in i provet(figur 1J-K').
    OBS: Hoppmuskeln verkar annorlunda än IFM. Om dissekera Mef2-Gal4 märkt muskel under fluorescens, hoppa muskel har en svagare fluorescens och en annan form och textur. Under normalt ljus verkar det nästan genomskinligt medan IFMs är en ogenomskinlig, mjölkgul(figur 1J-J',K).
13. Använd vattenspänning, fånga (men krossa inte) de dissekerade IFMs mellan ett par tångar (Figur 1L). Överför IFMs till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör förfyllt med 250 μL kylt 1x PBS(figur 1M). Fortsätt omedelbart med avsnitt 2.
    OBS: När tångspetsar förs in i närheten av varandra och lyfts ut ur en buffertlösning, orsakar vattenspänning en bubbla av buffert som fångas mellan tångspetsarna. Om IFMs också finns i denna bubbla kan de lyftas ur lösningen och enkelt överföras till ett annat buffertfyllt uttag. Det är viktigt att pressa tången för att få spetsarna nära varandra utan att röra varandra, för att undvika att macerating vävnaden fångas i buffertbubblan.

2. Pellet och bevara IFM-provet

1. Pellet IFMs genom att centrifugera 1,5 ml mikrocentrifugrör i 3–5 min vid 2 000 x g i en centrifug med bordsskiva (figur 2A,B).
2. Ta bort bufferten med en pipettspets (Bild 2C).
3. För RNA-tillämpningar, återanvänd IFM-pelleten i 50–100 μL av önskad RNA-isoleringsbuffert (se Materialförteckning, figur 2D). Fortsätt annars till steg 2.4.
   OBS: IFMs kan torrfrysas efter steg 2.2 för masspektrometripreparat eller isolering av RNA med kommersiella satser (se representativa resultat). För RNA-tillämpningar erhålls bättre resultat genom att omedelbart återanvända och frysa IFM-pelleten i isoleringsbuffert.
4. Frys provet på torris eller knäpp frys i flytande kväve (figur 2E). Förvara vid -80 °C tills den är klar för efterföljande steg i provberedningen för analys nedströms.
   OBS: Efter kryopreservation kan prover lagras i flera månader före bearbetning för nedströms undersökning.

Results

Figur 1: Dissekering av IFMs efter 48 h APF. A)Justering av puppar på dubbelstickstejp. b)Avlägsnande av puppor från poppväskan genom att öppna främre, skära fallet dorsalt(B') och lyfta ut poppan (B'). Cirkelsymboler representerade samma som figur 2. C)Överföring av puppar till buffert. D)Avlägsnande av ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
60 mm culture dishes	Sigma-Aldrich	Z643084-600EA	Greiner dishes, 60 mm x 15 mM, vented
Cell phone camera, Samsung Galaxy S9	Samsung	SM-G960F/DS	used for photos not taken under a microscope
Double stick tape	Scotch/3M	3M ID 70005108587	Double-sided tape, available at most office supply handlers
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Inox straight tip 11 cm forceps, Biology grade with 0.05 mm x 0.02 mm tip
fluorescent dissecting microscope camera, Leica DFC310 FX camera	Leica		www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope software, Leica Application Suite (LAS) version 4.0.0	Leica		www.leica-microsystems.com
Fluorescent dissecting microscope, Leica M165 FC	Leica		www.leica-microsystems.com
Fly: Bru1[M2]			Fly stock; This paper
Fly: Bru1[M3]			Fly stock; This paper
Fly: Mef2-GAL4	Bloomington Stock Center	BDSC:27390	Fly stock
Fly: salm[1]	Bloomington Stock Center	3274	Fly stock
Fly: salm[FRT]			Fly stock; see Spletter et al., Elife, 2018
Fly: UAS-Bru1IR	Vienna Drosophila Research Center	GD41568	Fly stock, RNAi hairpin
Fly: UAS-GFP::Gma	Bloomington Stock Center	BDSC:31776	Fly stock
Fly: UAS-mCD8a::GFP	Bloomington Stock Center	BDSC:5130	Fly stock
Fly: w[1118]	Bloomington Stock Center	3605	Fly stock
Fly: weeP26			Fly stock; see Clyne et al., Genetics, 2003
GFP detection reagent, GFP-Booster	ChromoTek	gba488-100
Glycogen	Invitrogen	10814-010
Image processing software, Photoshop CS6	Adobe		www.adobe.com
Isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516-25ML	2-propanol
Method 1 (RNA isolation): TRIzol	Life Technologies	15596018	Guanidinium isothiocyanate and phenol monophasic solution
Method 2 (RNA isolation): Method 1 + TURBO DNA-free Kit	Invitrogen	AM1907	TRIzol isolation followed by treatment with a kit to remove DNA
Method 3 (RNA isolation): Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit	Zymo Research	R2070S	RNA isolation in TRIzol, but over commercial columns instead of using phase separation. <br/>Recommended DNase treatment performed with Monarch Dnase I in Monarch DNase I Reaction buffer.
Method 4 (RNA isolation): RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	We used the provided DNase treatment. IFM pellets were homogenized in RTL buffer as suggested for animal tissues.
Method 5 (RNA isolation): ReliaPrep RNA Tissue Miniprep System	Promega	Z6110	We applied the protocol for 'Purification of RNA from Fibrous Tissues'.
Method 6 (RNA isolation): Monarch Total RNA Miniprep Kit	New England Biolabs	T2010G	We applied the protocol for tissues/leukocytes and lysed in 300 &micro;L of RNA Protection Reagent.
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher	AM12400	RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL
Microscope slides	Thermo Fisher	12342108	Standard slides, uncharged, 1 mm
Paintbrush	Marabu	1910000000	Marabu Fino Round No. 0, or similar brush from any art supply
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS buffer (1x)	Sigma-Aldrich	P4417	Phosphate buffered saline tablets for 1 L solutions, pH 7.4
PFA PureTip Pipette Tips	Elemental Scientific	ES-7000-0101	Optional substitute for standard pipette tips to reduce sample loss; 100 mL, 0.8 mm orifice
Pipette tips	Sigma-Aldrich	P5161	Universal 200 mL pipette tips
RNA concentration Approach 1 &amp; RNA integrity traces, Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA
RNA concentration Approach 2, Nanodrop	Thermo Fisher	ND-2000
RNA concentration Approach 3, Qubit 4 Fluorometer	Invitrogen	Q33238
RNase A	Promega	A7937
RNase-free water, Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	DEPC treat water overnight and then autoclave, to remove all RNase.
RT Kit #1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit	Invitrogen	18080-044	reverse transcription kit
RT Kit #2: LunaScript	New England Biolabs	E3010S	reverse transcription kit
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit	Qiagen	205410	reverse transcription kit
Statistical software: GraphPad Prism	GraphPad Prism		www.graphpad.com
Statistical software: Microscoft Excel	Microsoft		Purchased as part of the bundle: Office Home &amp; Student 2019
Table-top centrifuge	Eppendorf	5405000760	Eppendorf Centrifuge 5425 or equivalent
Tissue/ Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956	Standard tissue wipes
Transfer pipette	Sigma-Aldrich	Z350796	Plastic pipette
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-00	3 mm cutting edge, tip diameter 0.05 mm, length 8 cm
Whatman paper	Sigma-Aldrich	1004-070	Filter paper circles, Grade 4, 70 mm