Photomotor responsanalyse: En metode for å måle atferdsresponsen til Larval Zebrafish til en plutselig endring i lystilstand

Overview

Denne videoen beskriver den fotomotoriske responsanalysen av sebrafisk og fathead minnow larver ved hjelp av en automatisert sporingsprogramvare. Protokollen måler larvalfiskens atferdsrespons etter en plutselig endring i lystilstand.

Protocol

1. Kalibrering av videosporingsparametere

1. Før atferdsmessige tiltak må observasjons- og kalibreringsparametere angis i videosporprogramvaren (se Materialfortegnelse).
   1. Plasser en brønnplate i opptakskammeret med minst 1 larvfisk i en individuell brønn. Bruk platen og tilhørende fisk som representasjoner for å angi kalibreringsparametere.
   2. I videosporprogramvaren klikker du på "Fil | Generer protokoll, som åpner dialogboksen "veiviser for protokolloppretting". I feltet "Stedstelling" angir du antall enkeltbrønner på brønnplaten og klikker deretter "OK".
   3. Øverst på skjermen klikker du på "Vis | Fullskjerm", som vil be systemet om å vise en overhead kameravisning av brønnplaten.
   4. Klikk ikonet Tegn områder, som vises som tre flerfargede figurer. Til høyre for visningsområdet for brønnplaten velger du sirkelikonet i feltet merket "Områder".
   5. Bruk markøren til å avgrense det sirkulære videosporingsområdet øverst til venstre på brønnplaten. Velg Top-right og skisser deretter visningsområdet øverst til høyre godt. Velg deretter "Bunnmerke" for å skissere bunnen til høyre godt.
      MERK:Etter å ha tegnet den sirkulære omrisset, må plasseringen sannsynligvis justeres.  Hvis du vil justere plasseringen av omrisset, klikker du merk og bruker markøren til å flytte det omrisset området. Disposisjoner kan også replikeres ved å klikkeKopierog deretterLim inn.
   6. Etter at de øverste venstre, øverst til høyre og nederste høyre brønnsporingsområder er definert, klikker du på "Bygg" for å be programvaren om å automatisk avgrense visningsområdene til de resterende brønnene.
   7. I området merket "Kalibrering" klikker du på "Tegn skala". Bruk markøren til å tegne en vannrett linje over platen. Når linjen er tegnet, vises en dialogboks merket "Kalibreringsmåling". Angi brønnplatelengden og klikk "OK".
   8. Avslutt tegningsbehandleren ved å klikke på "Tegn områder" -ikonet.
   9. Klikk på "Fliser" -ikonet.  Bruk markøren til å utheve alle boksene som vises på visningsskjermen, slik at hver boks er grønn.
      MERK:Flisikonet vises som en gruppe på seks individuelle små firkanter
   10. "Klikk Vis| Full skjerm".  Til høyre for platevisningsområdet klikker du på "Bkg" i boksen merket "Detection Threshold". Bruk terskeljusteringslinjen til å angi terskelen for pikselgjenkjenning. Når den aktuelle terskelen for pikselregistrering er valgt, klikker du på "Bruk på gruppe".
       MERK:Denne protokollen setter deteksjonsterskelen til 13 i svart modus for sebrafiskobservasjoner og ved 110 i gjennomsiktig modus for fathead minnow observasjoner.
   11. I boksen merket "Bevegelsesterskel", skriv inn de ønskede bevegelseshastighetssporingsparametrene. Når hastighetsparametere er angitt, klikker du på "Bruk på gruppe".
       MERK:Denne protokollen setter små/store bevegelser ved 20 mm/s og inaktive/små bevegelser ved 5 mm/s. Disse valgene programmerer programvaren til å spore larvfiskbevegelser på tre forskjellige hastighetsnivåer: inaktiv (frysing) = <5 mm/s, liten (cruising) = 5–20 mm/s, og stor (sprengning) = >20 mm/s.
   12. Klikk på "Parametere | Protokollparametere" fra rullegardinmenyen. Velg kategorien Klokkeslett i dialogboksen. Angi observasjonstiden og integrasjonstiden. Etter at parametrene er angitt, klikker du på "Ok".
   13. For å stille inn lys / mørk fotoperiod ganger og lysintensitet for hver photoperiod åpne dialogboksen for lysdriverinnstillinger ved å velge "Lyskjøring" fra rullegardinmenyen "Parametere".
       MERK:Se protokollvideo for innstilling av flere lys-mørke fotoperioder.
   14. Når videosporingsparameterne er angitt, lagrer du observasjonsprotokollen.
       MERK:Denne protokollen observerer fiskens oppførsel over en periode på 50 minutter som inkluderer en 10 min akklimatiseringsfase etterfulgt av 4 endrede lys/mørke faser som består av to 10 minutters lysperioder og to 10 min mørke perioder. Integrasjonstiden er satt til å måle atferd for hvert minutt av den 50 min atferdsmessige studien.

2. Observasjon av Larval Fish Locomotor og Photomotor Behavior

1. Plasser brønnplaten som inneholder eksperimentell fisk i det atferdsmessige opptakskammeret.
2. I videosporingsprogramvaren åpner du sporingsprotokollen som er utviklet i neste trinn.
3. I videosporingsviseren må du kontrollere at alle larver er synlige på dataskjermen, at bare en individuell larve er til stede i hver brønn, og at individuelle brønner er justert innenfor observasjonsområdene som ble definert i trinn 1.1.5 og 1.1.6.
4. Klikk på "Eksperimenter | Utfør".
   MERK:Systemet vil be brukeren om å oppgi et navn og en plassering for å lagre observasjonsdataene.
5. Når navnet og lagringsstedet til observasjonsdataene er spesifisert, klikker du på ikonet "Flere live bilder" for å markere alle de forhåndsdefinerte visningsområdene
   MERK:Dette ikonet er plassert øverst på dataskjermen og vises som en boks delt inn i fire mindre firkanter. Hvis du klikker på dette ikonet, utheves alle de forhåndsdefinerte visningsområdene.
6. Lukk panelet i opptakskammeret og klikk på "Bakgrunn | Start" på dataskjermen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
48-well plates	Fisher Scientific	08-772-52	Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates	VWR	10062-896	Larval fathead minnow behavioral recording chambers