Mekanisk dissosiasjon: En metode for å skaffe levedyktige celler fra et vev

Abstract

Kilde: Garaud et. al., A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for analyse av infiltrerende lymfocytter. J. Vis. Uttr. (2014).

Denne videoen beskriver den ikke-enzymatiske dissosiasjonen av friskt menneskelig vev for å oppnå levedyktige celler. Teknikken brukes til kvalitativ og kvantitativ analyse av CD45 positive celler (lymfocytter/leukocytter) tilstede i ulike normale og ondartede menneskelige vev.

Protocol

1. Forberedelse av vevet homogenat

1. Dissekerte resected vev (ondartet og normalt vev resected fra operasjonsrommet) er i patologi lab av opplært personell for umiddelbar henting. Tumor, NANT (tatt lengst avstand fra svulsten som mulig) og normale vevsfragmenter behandles rutinemessig innen 1 - 3 timer kirurgisk eksisjon i et BSL2-laboratorium ved hjelp av standard biosikkerhetsprosedyrer for humant vev. Et flytskjema for protokollen er illustrert i figur 1.
2. Vei alle vevsfragmenter (normal, NANT og svulst) og mål lengde, bredde og høyde (lengde x bredde x høyde). Dette er et viktig skritt for etterfølgende normalisering av celle subpopulations, ekstrahert RNA, etc.
   MERK: Utvalget av prøvestørrelse er 100 til 10.000 mm³ uten fett om mulig.
3. Avtrykk tumorfragmentet på et glasssklie for H&E-farging for å bekrefte at vevet faktisk er en del av svulsten.
   1. Gjør dette ved å trykke på et glassmikroskop på tumorfragmentet og påføre forsiktig trykk med fingrene i noen sekunder.
   2. Fest lysbildet med isopropanol i 2 minutter etterfulgt av et vasketrinn i vann. Motvirke vevet i 30 sek med Mayers hematoksylin.
   3. Vask lysbildet i seks bad med vann. Flekk i Phloxine B 2% i 15 sek.
   4. Vask i ett vannbad etterfulgt av fire bad isopropanol og avslutt med ett vannbad.
   5. Inkuber i isopropanol i 1 min og avløp. Klar i to bad av xylen.
   6. Monter med xylenbasert monteringsmedium. Undersøk for tumorcelleitet (figur 2).
      MERK: Hovedsakelig holder tumorceller seg til den trykte lysbildet - de stromale, lymfoide eller fettcellene forblir sjelden, og etterlater mellomrom mellom tumorcellene (Figur 2).
4. Legg vevsfragmentet i en liten kulturrett som inneholder 1 ml av det kjemisk definerte, serumfrie hematopoietiske cellemediet (heretter kalt medium) ved romtemperatur og terninger det i små biter (~ 1 - 2 mm²) ved hjelp av en steril skalpell.
5. Overfør alt (vevsfragmenter + medium) til et mekanisk dissosiator C-rør.
6. Skyll Petri-parabolen og skalpell med 2 ml medium ved hjelp av en Pasteur pipette og legg dette til C-røret (volum medium for dissosiasjon = 3 ml).
7. Bruk det mekaniske dissosiatorprogrammet A.01 for C-rør (det mest skånsomme programmet) for å homogenisere vevsfragmentene til en enkelt celleoppheng. Plasser C-røret i apparatet og kjør programmet to ganger etter hverandre (en syklus = 25 sek).
   MERK: Denne homogeniseringsprosedyren er etablert og validert for humant brystvev, andre tumor- eller vevstyper kan trenge å bruke et annet program og bør testes først.
8. Fjern C-røret fra apparatet og dekanter homogenatet direkte inn i en 40 μm cellesil som sitter på et 50 ml rør. Bruk samme Pasteur pipette som i trinn 1.6, overfør eventuell væske som er igjen i C-røret til cellesilen.
9. Overfør den filtrerte væsken til et 15 ml rør ved hjelp av en 1 ml mikropipettespiss. Hold cellesilen og dens 50 ml rør midlertidig.
10. Skyll C-røret med ytterligere 3 ml medium og overfør dette, igjen med samme Pasteur pipette som i trinn 1.6, til cellesilen som fortsatt sitter på 50 ml-røret. Klem en maksimal mengde gjenværende væske fanget i det uhomogeniserte vevet inn i 50 ml-røret ved å forsiktig flytte det rundt silen med en ren Pasteur pipette eller 1 ml spiss som senere kastes bort for å unngå å forurense eluatet.
11. Plasser cellesilen opp ned på det originale C-røret og skyll med 3 ml medium slik at det upogeniserte vevet faller tilbake i C-røret.
12. Homogeniser på nytt som i trinn 1.7 for to sykluser i A.01-programmet.
13. Hell dette andre homogenatet gjennom cellesilen som sitter på 50 ml-røret, skyll C-røret igjen med 3 ml medium (som i trinn 1.10) og overfør med Pasteur-pipetten til cellesilen som sitter på 50 ml-røret igjen klemmer en maksimal mengde væske fra det gjenværende bindevevet som er fanget i cellesilen.
14. På dette tidspunktet er et volum på ~ 2,5 ml i 15 ml rør og ~ 9 ml i 50 ml rør.

2. Separasjon av vevet supernatant og celler

1. Sentrifuger homogenatene i 15 ml og 50 ml rør i 15 min ved 600 x g ved romtemperatur.
2. Dekanter SN fra 15 ml-røret til et rent rør og oppbevar det midlertidig ved 4 °C. Denne supernatant = primærsvulst, NANT eller normalt vev SN (sluttvolum 2,5 ml) blir senere avklart og aliquoted før lagring ved -80 °C for fremtidige analyser (se nedenfor).
3. Kast supernatanten fra 50 ml røret.
4. Resuspender forsiktig begge cellepellets i et sluttvolum på 1 ml medium. Kort sagt, bryt først cellepelleten forsiktig i begge rørene (ved å trykke på røret på en hard overflate). Resuspend løs celle pellet i 50 ml med 500 μl medium og overføre denne cellen suspensjon til 15 ml rør for å resuspend den andre pellet. Gjenta dette trinnet en gang med det andre 500 μl medium for maksimal gjenoppretting av celler.
5. Overfør 10 μl av cellefjæringen til et lite rør, bland med 10 μl trypanblå (fortynning 1:1) og tell antall levedyktige celler ved hjelp av et hemocytometer.
   MERK: På dette tidspunktet kan en brøkdel av cellesuspensjonen også analyseres ved strømningscytometri for å evaluere cellestørrelse, granularitet og om ønskelig et begrenset antall subpopulasjonsmarkører for mer presis vurdering av den relative cellefordelingen i homogenatet før omfattende analyse eller eksperimentering. Alle analyser ved strømningscytometri inkorporerer CD45-merking for normalisering av delpopulasjoner.
6. Pellet cellene ved sentrifugering ved 300 x g i 10 min ved romtemperatur. Cellene fra svulsten, NANT eller normalt vev er nå klare for videre rensing eller analyse. Disse ekstra trinnene er best når de utføres samme dag som kirurgi.
   MERK: For strømningscytometrisk analyse, men ikke cellesortering, bør de gjenværende røde blodcellene lyses etter antistoffmerking ved å legge til 0,4 ml rød blodcelle lysisbuffer til cellepelleten, umiddelbart virvel i 1 sek og inkuberer minst 10 minutter ved romtemperatur (beskyttet mot lys) før analyse.

3. Avklaring av tissue supernatant

1. Sentrifuger de 1,5 ml rørene med vev SN ved 15.000 x g i 15 min ved 4 °C.
2. Fjern forsiktig supernatanten uten å berøre eller forstyrre pelletsen. Overfør til et rent rør (eller rør) avhengig av antall og volum aliquots ønsket.
3. Oppbevar supernatanten ved -80 °C for fremtidig bruk.

Results

Figur 1: Protokollflytskjema. Vår prosedyre for behandling av friskt humant vev og noen analytiske tilnærminger som senere kan brukes til å vurdere lymfocytter som infiltrerer menneskelig vev, vises.

Figur 2: H&E farget bilde av et brystsvulstvevsavtrykk. Dette avtrykket, tatt fra et friskt brys...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator 	Miltenyi Biotec	 130-093-235	 BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R 	Eppendorf 		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R 	 Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet  	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope 	Nikon eclipse TS100		 or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield  		640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer 	Beckman Coulter		 or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube   	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish  	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel   	Swann-Morton	510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm   	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml   	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml  	Becton Dickinson	352097	 or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml  	 Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml   	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml   	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20   	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline   	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue   	VWR	17942E	or other vital stain