Beispielvorbereitung für Metabolomik: Eine Methode zur Vorbereitung von Zellproben für metabolitische Profilierung

Overview

Dieses Video beschreibt eine Technik zur Vorbereitung von Brustkrebszellproben für die Metabolitenprofilierung. Brustkrebszellen werden mit Estradiol behandelt, das an den Östrogenrezeptor alpha bindet und veränderungen in der Metabolitenzusammensetzung bewirkt.

Protocol

1. Metabolomics Assay Probenvorbereitung

1. Zellkultur und -behandlung
   1. Samen 400.000 MCF7-Zellen pro 10 cm Platte im Wachstumsmedium. Für jede Behandlung bereiten Sie drei Proben vor. Verwenden Sie zwei Platten in jeder Probe, um genügend Zellen für die Erkennung zu erhalten. Am 3. Tag das Medium entfernen und 5 ml frisches Medium mit oder ohne 10^-8 M Estradiol oder E2 in die Zellen geben. Behandeln Sie die Zellen für 24 Stunden (37 °C in befeuchteter 5%_{CO2-Atmosphäre).}
2. Beispielsammlung
   1. 5 ml eiskalt 1x PBS auf die Platte geben, die PBS nach einem kurzen Mehrfachkippen ansaugen. Wiederholen Sie dies zweimal, und entfernen Sie so viel PBS wie möglich nach der letzten Wäsche.
   2. Fügen Sie auf jeder Platte 750 l vorkaltes Aceton hinzu und kratzen Sie die Zellen. Kombinieren Sie die Zellen in Aceton von zwei Tellern zu einem 2 ml Tube auf Eis.
   3. Zellzahl für Normalisierung
      1. Verwenden Sie für jede Behandlung zwei zusätzliche Platten für die Zellquantifizierung. Um die Zellen von der Platte zu de-attachieren, fügen Sie 2 ml HE-Puffer (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO_{3 und} 1 mM EDTA) in jede Platte und inkubieren für 5 min.
      2. Sammeln und mischen Sie die Zellen gut, indem Sie Zellen im HE-Puffer pipetieren. Verwenden Sie insgesamt 20 l Zelllösung, um die Zellzahl mit einem Hämozytometer zu zählen.
3. Bewahren Sie die Proben bei -80 °C auf, bevor Sie sie an das Metabolomics-Zentrum senden, um die Metaboliten mithilfe der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)-Analyse zu identifizieren und zu quantifizieren.