染色质免疫沉淀（ChIP）检测人细胞中基因激活表达过程中的动态组蛋白修饰

摘要

本方案描述了如何利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术研究由信号转导通路诱导的转录调控过程中染色质模板发生的动态改变。

摘要

在多种细胞外配体的刺激下，STAT（信号转导子和转录激活子）转录因子会迅速从细胞质中的静息状态被招募至细胞表面受体，并在单个酪氨酸残基上发生磷酸化而被激活¹。随后，它们形成二聚体并转入细胞核，驱动靶基因的转录，从而影响细胞生长、分化、稳态及免疫应答。鉴于STAT因子广泛参与正常的细胞生理过程，其功能失调与人类疾病密切相关，尤其是癌症²和自身免疫性疾病³。

已有充分证据表明，转录过程受到染色质模板改变的调控^4,5。这些改变包括ATP依赖性复合物的活性，以及组蛋白的共价修饰和DNA甲基化⁶。由于STAT激活基因表达具有快速且短暂的特点，因此需要特定的机制来调控依赖STAT的基因位点上的染色质模板。为了明确这些机制，我们对响应STAT信号通路的基因位点上的组蛋白修饰及其产生这些修饰的酶活性进行表征。本实验方案描述了染色质免疫沉淀技术，该方法在研究STAT信号通路对活化基因表达中染色质的调控方面具有重要价值。

方案

规划

计划进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验的前一天，应培养细胞以确保获得足够数量的细胞。假设每次ChIP检测需要约1-1.5 × 10⁷个细胞。务必同时设置阴性对照（IgG）和阳性对照（pan组蛋白抗体），并进行重复实验。
提示 - 对于2FTGH细胞，每次ChIP检测大约需要一个直径15 cm、汇合度为80%的组织培养皿。

第一部分：制备染色质并进行染色质免疫沉淀（ChIP）

1. 移除培养基，并用含有5 ng/mL IFN-γ的20 mL 10% 天然小牛血清（CCS）/DMEM培养基诱导细胞，诱导时间按实验要求进行。同时，将未诱导组培养板中的培养基更换为20 mL 10% CCS/DMEM。
2. 在通风橱中，加入 540 μL 将37%甲醛加入15 cm培养皿的培养基中，至终浓度为1%（总体积20 mL）。
   提示 - 倾斜培养板，将甲醛加入培养基液滴中，然后轻轻摇动培养板使其均匀分布。
3. 室温下孵育10分钟以完成交联反应。
4. 加入甘氨酸至终浓度为 0.125 M，以终止交联反应。
5. 吸除培养基，用10 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。
6. 用....

讨论

本实验方案中所述的染色质免疫沉淀（ChIP）方法已在实验室成功用于检测二十多种不同的组蛋白修饰。此外，我们还利用该方法表征了在多种干扰素-γ（IFN-γ）诱导基因上，转录因子、组蛋白修饰酶、识别组蛋白修饰的蛋白质以及RNA聚合酶II转录机器的占据情况变化。我们还应用该流程分析了癌症干细胞分化过程中组蛋白修饰的动态变化¹⁰。

ChIP 数据的质量最终取决于所用抗体的有效性，而不同抗体之间的效果存在较大差异。因此，未能通过 ChIP 检测到某种修饰，并不能解释为该修饰不存在。此外，在 ChIP 实验中观察到的某种特定修饰的变化，可能仅仅反映了由于邻近残基上其他组蛋白修饰的存在，导致抗体对表位识别能力的改变。因此，必须通过能够将组蛋白修饰的观察变化与生物学结果相关联的方法来验证 ChIP 结果。当做到这一点时，ChIP 就成为研究染色质相关机制如何参与基因表达调控的一种强有力手段。

....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
37% 甲醛	Fisher Scientific	BP531-500
氯仿/异戊醇	Acros Organics	AC32715-5000
Complete Mini 蛋白酶抑制剂	Roche Group	1836153
胎牛血清	Hyclone	SH30087.04N
DMEM	Hyclone	SH30243
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500
乙醇	Pharmco Products, Inc.	zp1110EP
甘氨酸	Roche Group	100149
糖原	Roche Group	901393
HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
IFN-gamma	R&D Systems	285-IF-100
IgG	Jackson ImmunoResearch	109-005-003
KCl	MP Biomedicals
LiCl	Sigma-Aldrich	L4408
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
醋酸钠	Fisher Scientific	BP333-500
脱氧胆酸钠盐	Fisher Scientific	BP349-100
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5
NP40	US Biological	N3500
抗组蛋白 H3, CT, pan	EMD Millipore	07-690
苯酚/氯仿/异戊醇	Fisher Scientific	108-95-2
磷酸盐缓冲液	Fisher Scientific	7647-14-5
PMSF	EMD Millipore	50-230-0316
蛋白酶 K	5 PRIME	2500140
RNase A	5 PRIME	2500130
鲑精 DNA/Protein A 琼脂糖	EMD Millipore	16-157
鲑精 DNA/Protein G 琼脂糖	EMD Millipore	16-201
SDS	Fisher Scientific	BP166-500
Tris-Cl	Sigma-Aldrich	T5941
Triton X-100	Acros Organics	327372500
抗-K36me3	Abcam	ab9050
抗-STAT1	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-345X
抗-RNA 聚合酶 II	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-899