Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) verwendet wird, um den dynamischen Veränderungen der Chromatin-Vorlage, die Transkription von einem Signaltransduktionsweg induziert regulieren zu studieren.
Abstract
In Reaktion auf eine Vielzahl von extrazellulären Liganden, die STAT (Signal Transducer und Aktivator der Transkription) Transkriptionsfaktoren werden schnell von ihren latenten Zustand im Zytoplasma an Zelloberflächenrezeptoren, wo sie durch Phosphorylierung an einem Tyrosin-Rest 1 aktiviert werden rekrutiert. Dann dimerisieren und in den Zellkern transloziert, um die Transkription von Zielgenen fahren, die sich auf Wachstum, Differenzierung, Homöostase und der Immunantwort. Es überrascht nicht, angesichts ihrer weit verbreiteten Einbindung in normale Zelle Prozesse trägt Dysregulation der STAT-Funktion, um menschliche Krankheiten, insbesondere Krebs 2 und autoimmune Krankheiten 3.
Es ist bekannt, dass die Transkription von Änderungen ist es, die Chromatin-Template 4,5 geregelt. Diese Veränderungen umfassen die Aktivitäten von ATP-abhängigen Komplexen, sowie kovalenten Histon-Modifikationen und DNA-Methylierung 6. Da STAT Aktivierung der Genexpression ist schnell und transient, bedarf es spezifische Mechanismen für die Modulation der Chromatin-Template an STAT-abhängigen Gen-Loci. So definieren Sie diese Mechanismen charakterisieren wir die Histon-Modifikationen und die enzymatischen Aktivitäten, die sie an Genorte, die STAT-Signalisierung reagieren zu generieren. Dieses Protokoll beschreibt Chromatinimmunpräzipitation, eine Methode, die wertvoll für das Studium der STAT-Signalisierung an Chromatin in aktiviert die Genexpression.
Protocol
PLANUNG
Der Tag vor einem ChIP Experiment geplant ist, sollten die Zellen kultiviert, so dass eine ausreichende Anzahl zur Verfügung steht. Angenommen, dass jeder ChIP-Assay wird ~ 1-1,5 x 10 7 Zellen benötigen. Immer Plan, sowohl die negative (IgG) und positive (Pan-Histon-Antikörper) Kontrollen und doppelte Experimente zu tun.
Tipp - 2FTGH Zellen benötigt jeder ChIP Assay etwa ein 15 cm Gewebe Kulturschale bei 80% Konfluenz.
TEIL 1: PREPARE Chromatin und PERFORM ChIP
- Entfernen Kulturmedien und induzieren Zellen für die Zeiten mit 20 ml 10% kosmischen Kälberserum (CCS) / DMEM mit IFN-gamma bei 5 ng / mL benötigt. Ersetzen Sie die Medien auf die induzierten Platten mit 20 ml 10% CCS / DMEM sowie.
- In einer Abzugshaube, fügen Sie 540 ul 37% Formaldehyd und 20 ml Medium (1% Endkonzentration) in der 15 cm Schüssel.
Tip - Tilt Platte und fügen Sie die Formaldehyd zu den Medien Pool - dann Felsplatte, um es gleichmäßig verteilt. - Lassen Vernetzung für 10 Minuten bei Raumtemperatur ablaufen.
- Add Glycin bis 0,125 M Endkonzentration, um die Vernetzung zu stoppen.
- Vakuum absaugen Medien und waschen Sie die Zellen einmal mit 10 mL eiskaltem Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Sammeln Sie Zellen mit einem Zellschaber in ~ 7 mL PBS und kombinieren Zellen (von 6 Platten), die identisch in 50 mL konischen Rohr auf Eis behandelt wurden.
- Zentrifuge (Beckman Coutler Allegra 12-R Zentrifuge) bei 1800 rpm bei 4 ° C für 5 Minuten und saugen Sie den PBS.
Tipp - Snap freeze das Zellpellet wenn hier anzuhalten und bei -80 ° C. - Zellpellet in 4 ml Schwellung Buffer (25 mM HEPES pH 7,8, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 0,1% NP40. Hinzufügen 1 mM DTT, Complete Protease-Inhibitoren und Chill auf Eis vor dem Gebrauch) und Transfer zu einem 15 mL konischen Rohr.
Tip - Diese Schwellung Puffervolumen ist angemessen für einen 6-Platte Pooling (~ 6-9 x 10 7 Zellen). Mehr oder weniger Puffer ändern könnte die douncing Effizienz. - Inkubieren Sie die Zellsuspension auf Eis für 10 Minuten.
- Transfer-Suspension in eine vorgekühlte 15 ml douncer (Wheaton) und Dounce 20 Hübe mit Pistill A.
- Transfer dounced Zellen wieder in eine 15 ml konische Röhrchen auf Eis.
- Zentrifugation bei 2500 rpm für 5 Minuten bei 4 ° C und den Überstand verwerfen.
- Resuspendieren Kernpellet (~ 200 ul von 6 Platten) in 3 mL (15 Pellet-Volumen) der Beschallung Buffer (50 mM HEPES pH 7,9, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS. hinzufügen Komplett-Protease-Inhibitoren und Chill auf Eis kurz vor dem Gebrauch).
Tipp - Das Ultraschall Puffervolumen ist angemessen für einen 6-Platte Pooling (~ 6-9 x 10 7 Zellen). Mehr oder weniger Puffer ändern könnte die Beschallung Effizienz. - Ultraschallbad Kerne Suspension auf Eis für 10 Zyklen (20 Sekunden on/40 Sekunden aus / Einstellung der Amplitude von 8) mit einem Misonix Sonicator 3000 mit der Mikrospitze ausgestattet. Dies führt in der Regel Chromatinfragmenten durchschnittlich 200-1000 bps in der Größe.
Tip - Da sonicators variieren, die Beschallung Effizienz muss empirisch ermittelt werden. Dazu nehmen Aliquots von 20 ul vor Beschallung und nach jeder Beschallung Zyklus. Hitze dieser Proben bei 65 ° C für 4 Stunden. Fügen Sie DNA-Ladepuffer und Ausführen eines Standard 1% Agarose / TBE-Gel, um DNA-Fragmente sichtbar zu machen.) - Transfer beschallt Material zu einem SS34-Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 20 Minuten bei 4 ° C bei 13000 rpm in einem SS34-Rotor (Sorvall RC6 Plus-Zentrifuge), um Pellets, was ist in der Regel eine kleine Menge von Zelltrümmern.
- Vorsichtig den Überstand in ein konisches 15 ml Röhrchen auf Eis.
- Pre-clear, indem 360 ul Salmon Sperm DNA / Protein A oder G Agaroseperlen Gülle und Schütteln bei 4 ° C für mindestens 30 Minuten.
Tipp - Dieser Schritt nimmt das Rauschen im Test, die von nicht-spezifische Bindung Ereignissen beruht. - Zentrifugation bei 1000 rpm bei 4 ° C für 5 Minuten auf dem Pellet Agaroseperlen.
- Transfer bereits geklärten Überstand in einen anderen 15 ml konische Röhrchen auf Eis.
- Messen Sie die A260-Einheiten der pre-cleared Chromatin und die Lautstärke mit Ultraschall Buffer zu vier (4) A260-Einheiten (0,2 mg / mL davon 1 A260 Einheit = 0,050 mg / ml)
Tipp - Um die A260-Einheiten zu messen, verwässern 10 ul bereits geklärten Chromatin in 190 ul DDW; blank Spektralphotometer mit 10 l Ultraschall-Puffer in 190 ul DDW. - Sparen Sie 75 ul des Chromatins (bei 4 A260-Einheiten) als Eingangs-Sample und lagern bei 20 ° C bis zu seiner Vernetzungen umkehren.
Tipp - Dieser Schritt ist entscheidend für die Datenanalyse. Vernachlässigen Sie nicht auf den Eingang Aliquot nehmen. - Aliquot der vorbereiteten Chromatin auf 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf ice als 1 mL Aliquots.
Tipp - Wenn hier anzuhalten, Snap einfrieren vorbereitet Chromatin auf Trockeneis und bei -80 ° C. NB: gespeichert Chromatin abbauen kann, die weniger als optimale Ergebnisse, so vermeiden, wenn möglich. - Fügen Sie die ChIP-grade-Antikörper gegen den induzierten und nicht-induzierten Proben-Sets in zweifacher Ausfertigung. Add IgG (2 g) und pan Histone H3 Antikörper (15 ul) als die negativen und positiven Kontrollen zur induzierten und nicht-induzierten Proben-Sets.
Tipp - Die Menge des Antikörpers zu nutzen muss empirisch ermittelt werden oder auf der Lieferanten Produktblatt vorgeschlagenen Mengen. In der Regel 1-2 ug aus einem Chip-grade Antikörper gut funktioniert. Das entsprechende Volumen muss empirisch für Antikörper, die als Serum versorgt sind, bestimmt werden. - Rock Alle Rohre über Nacht bei 4 ° C.
TEIL 2: COLLECT Immunkomplexen
- Add 60 ul Salmon Sperm DNA / Protein A oder Protein G Agarose-Beads Gülle zu allen Rohren.
Tipp: Verwenden Protein A für polyklonalen Kaninchen-Antikörper und Protein G für monoklonalen Maus-Antikörper. - Rock bei 4 ° C für mindestens 60 Minuten.
- Pellet die Immunkomplexe (Agaroseperlen) durch microfuging sanft bei 2000 rpm bei 4 ° C für 3 Minuten.
- Den Überstand aspirieren.
- Waschen Sie die Immunkomplexe mit 1 ml jedes der folgenden Waschpuffer für 10 Minuten unter Schütteln bei 4 ° C. Microfuge für 3 Minuten bei 2000 rpm bei 4 ° C zwischen jedem Waschen und Absaugen des Überstandes. Keep Proben auf Eis gekühlt. Add PMSF kurz vor dem Gebrauch.
- Low Salt Wash - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF
- Hohe Salt Wash - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 mM PMSF
- LiCl Wash - 0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% Natriumdesoxycholat, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM PMSF
- TE Wash - zwei Waschgänge mit TE-Puffer -10 mm Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF
- Entfernen Sie die letzten TE-Puffer zu waschen und die Perlen, 500 ul Elutionspuffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS).
Tipp - Der Elutionspuffer sollte frisch zubereitet werden. - Vortex zu Agaroseperlen in Elutionspuffer und Wärme-Mix für 30 Minuten bei 65 ° C.
Tipp - Jedes Röhrchen mindestens alle 10 Minuten während dieser 30 Minuten. - Microfuge für 30 Sekunden bei 2000 rpm und Transfer des Eluenten zu einer neuen Mikrozentrifugenröhrchen.
Tipp - Während der Elution auftauen Ihre Eingabe Proben und fügen 500 ul Elutionspuffer auf jeden einzelnen. Fügen Sie diesen Proben in alle Schritte für die Zukunft. - Add 5 M NaCl auf eine Endkonzentration von 200 mM zu allen Proben und Wirbel.
- Inkubation bei 65 ° C über Nacht (oder mindestens 4 Stunden).
TEIL 3: PURIFY ChIP'd UND INPUT DNA
- Microfuge alle Proben für 30 Sekunden, um Kondensation an Deckeln zu sammeln.
- Add 1μL von RNAse A (10 U / mL) in jedes Röhrchen und inkubieren bei Raumtemperatur für 15 Minuten.
- Fügen Sie 10 ul 0,5 M EDTA, 40 ul 0,5 M Tris-Cl pH 6,5, 2 ul Proteinase K (10 mg / mL) und inkubieren bei 45 ° C für 60 Minuten. Tipp Bereiten Sie einen Master-Mix dieser Reagenzien und fügen 52 ul in jedes Röhrchen.
- Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol extrahiert und dann Chloroform / Isoamylalkohol extrahiert die Proben.
- Add 2 ul Glykogen (25 ug / mL) und 0,1 Volumen 3M Na-Acetat pH 5,2 und Wirbel.
- Add 2,5 Volumen 100% Ethanol und vortexen.
- Inkubation bei 20 ° C über Nacht.
TEIL 4: Entschlacken ChIP'd UND INPUT DNA FORTSETZUNG
- Microfuge Proben für mindestens 20 Minuten bei 13000 rpm bei 4 ° C zur Fällung der DNA / Glycogen Pellets.
- Waschen mit DNA / Glykogen-Pellets mit 1 ml 70% Ethanol.
- An der Luft trocknen Pellets oder trocknen schnell in DNA Savant Speed Vakuumzentrifuge.
Tip - nicht über trockenem die DNA. - Resuspendieren DNA / Glykogen-Pellets in 200 ul TE-Puffer.
- DNA (1 ul) ist bereit für die Quantifizierung mittels Real-time PCR. Shop restlichen DNA bei 20 ° C.
Tip - Mit mehr als 1 ul DNA kann die real-time PCR Reaktionen hemmen, so Scale-up mit Vorsicht.
Teil 5: Repräsentative Ergebnisse:
ChIP und Input DNA-Proben werden mit Real-Time PCR 7,8 (Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System) unter Verwendung von Primern spezifisch für die Gen-Locus der Zinsen quantifiziert. Primern, die genomische Sequenz bekannt ist in angereichert werden oder fehlen in der Histon-Modifikationen zu untersuchenden können als positive und negative Kontrollen verwendet werden. Die Daten werden als Prozentsatz der Eingang vorgestellt. Die ChIP Verfahren sollte ganz sein repeated mit drei biologischen Replikaten gemeldet Veränderungen in Histon-Modifikationen sind statistisch signifikant zu gewährleisten.
Es gibt mehrere wichtige Aspekte zu berücksichtigen bei der Verwendung von Echtzeit-PCR, DNA, einschließlich Primer-Design, PCR-Effizienz und der geeignete Weg, um den Prozentsatz der Ein-und Normalisierung Verfahren berechnen zu quantifizieren. Wenn Profiling Histonmodifikationen Belegung über ein Gen, muss die PCR-Effizienz werden unter allen Primerpaaren konsistent. Die real-time PCR-System Hersteller kann die erforderlichen Informationen und Unterweisungen.
Abbildung 1 zeigt repräsentative Ergebnisse von Chromatin Immunopräzipitation während STAT1 Aktivierung des IRF1 Gen 9, ausgelöst durch IFN-γ.
Abbildung 1. Belegung von STAT1, RNA Polymerase II und H3K36me3 während STAT1 Aktivierung des Gens IRF1 dynamisch. (A, B, C) ChIP mit α-H3K36me3, α-STAT1 und α-Pol II von Chromatin aus 2FTGH Zellen gesammelt mit IFN-γ für 30 Minuten (rote Quadrate), 1,5 Stunden (blaue Kreise), 5 Stunden (induzierte grüne Dreiecke) oder nicht-induzierten (schwarze Rauten). IgG ist der Negativ-Kontrolle (grau Kreuze). (D) Pan H3 die positive Kontrolle ist und zeigt die Histon-Belegung in den Ort in der induzierten (blaue Kreise) und nicht-induzierten Bedingungen (schwarze Rauten). Der Dip ca. -5 bp ist auf die Nukleosomen Erschöpfung, die bei Ablese-Startpunkten gefunden wird.
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Discussion
Die ChIP-Protokoll beschrieben wurde erfolgreich im Labor zum Testen mehr als zwanzig verschiedenen Histon-Modifikationen eingesetzt. Darüber hinaus haben wir Änderungen in der Belegung von Transkriptionsfaktoren charakterisiert, Histon-modifizierende Enzyme, Proteine, die Histon-Modifikationen und der RNA Polymerase II Transkription Maschinen zu erkennen, an mehreren IFN-γ induzierten Genen. Wir haben auch das Verfahren verwendet werden, um Veränderungen in Histon-Modifikationen während der Differenzierung von Krebsstammzellen Zelle 10 zu charakterisieren.
Die Qualität der Chip-Daten letztlich hängt die Wirksamkeit des Antikörpers verwendet, und es gibt beträchtliche Unterschiede zwischen den Antikörpern. Das Versäumnis, eine Modifikation ChIP, kann daher nicht interpretiert werden, dass dieser Änderung nicht vorhanden ist. Darüber hinaus können Änderungen in einer bestimmten Modifikation in einem Chip Experiment beobachtet spiegeln lediglich eine Änderung in der Anerkennung des Epitops des Antikörpers durch zusätzliche Histon-Modifikationen im nahe gelegenen Rückstände verursacht. Daher müssen ChIP Ergebnisse mit den Ansätzen, dass die beobachteten Veränderungen in einem Histonmodifikationen einer biologischen Ergebnis wird beziehen validiert werden. Wenn dies geschehen ist, ist ChIP eine leistungsfähige Methode zur Chromatin-basierte Mechanismen, die zur Regulation der Genexpression beitragen zu studieren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird von der University of Virginia, der University of Virginia Cancer Center und The Thomas F. und Kate Miller Jeffress Memorial Trust unterstützt. Wir danken den James E. Darnell Lab (Rockefeller University) der Robert Ross Lab (Fordham University) für die Zell-Linien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche Group | 1836153 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Ethanol | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| Glycine | Roche Group | 100149 | |
| Glycogen | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-Histone H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| Proteinase K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNAse A | 5 PRIME | 2500130 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
References
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