Metástase experimental e CTL Adoptive Transferência Modelo rato Imunoterapia

Summary

Uma metástase pulmonar experimental e modelo de rato CTL imunoterapia para a análise da interação de células tumorais de células-T

Abstract

Modelo de camundongo experimental de metástase é um modelo simples e metástase ainda fisiologicamente relevantes. As células tumorais são injetadas por via intravenosa (iv) nas veias da cauda do rato e colonizar nos pulmões, assim, assemelhando-se os últimos passos de metástase de células tumorais espontânea: a sobrevivência na circulação extravasamento, e colonização nos órgãos distal. Do ponto de vista terapêutico, o modelo experimental de metástase é o modelo mais simples e ideal uma vez que o alvo das terapias é freqüentemente o ponto final de metástase: estabelecida tumor metastático no órgão distal. Neste modelo, as células tumorais são injetadas nas veias da cauda iv mouse e permitido para colonizar e crescer nos pulmões. Tumor-específico CTLs são injetados iv no mouse metástases de rolamento. O número eo tamanho das metástases de pulmão pode ser controlada pelo número de células tumorais para ser injetada eo tempo de crescimento do tumor. Portanto, vários estágios de metástase, metástase do mínimo para metástases extensas, pode ser modelada. Metástases pulmonares são analisados ​​pela inflação com tinta, permitindo fácil observação visual e quantificação.

Protocol

1. Modelo Experimental rato Metástase

1. No dia antes da injeção das células tumorais, uma semente T75 frasco com até 1 x 10 ⁷ CMS4-Met células em 10 mL de meio RPMI contendo 10% de soro para obter rápido crescimento de células tumorais. Incubar durante a 37 ° C.
2. No dia da injeção, remova a mídia e lave as células uma vez com PBS, em seguida, colher as células tumorais com 0,05% de tripsina-EDTA a 37 ° C por 5 minutos. Parar a reação com 10 mL de meio RPMI contendo 10% de soro. Transferência de células para um tubo cônico.
3. Girar as células a 1300 rpm em uma centrífuga Sorvall RT Legend por 3 minutos em temperatura ambiente. Remover o sobrenadante. Ressuspender as células em 10 mL fresco 1X HBSS para lavar, então girar novamente e ressuspender da mesma maneira.
4. Contagem de células tumorais em um hemocitômetro. Diluir as células em HBSS, de modo que as células necessárias para cada injeção são ressuspenso em um volume total de 100 mL.
5. Aqueça o 6-8 semanas de idade camundongos BALB / c em um copo imersos em água morna para dilatar a veia da cauda. Posicione o mouse em um limitador veia da cauda no banco. Use uma micro para injetar 100 L de células tumorais na veia da cauda lateral. Utilizar técnicas assépticas para evitar a infecção. Após a injeção, aplique uma leve pressão no local da injeção até que o sangramento parou.
6. Devolver o mouse para a gaiola, e permitir que o tumor crescer para a fase desejada.

2. Citotóxicos T-linfócitos (CTL) Imunoterapia transferência adotiva

1. No dia da transferência, pipeta cima e para baixo para voltar a suspender citotóxicos purificada linfócitos T, ou CTLs, preparado como descrito no texto. Transferência de todas as células de uma placa para um tubo cônico de 15 mL, não deixando o volume exceder mais de 2 / 3 do tubo.
2. Inserir um estéril Pasteur pipeta no tubo cônico e leigos meio de separação de Linfócitos, ou LSM, sob as células até que o volume total se aproxima de 14 mL.
3. Tenha cuidado para não perturbar as camadas. Centrifugar a 2000 rpm por 20 minutos em temperatura ambiente. Não use o freio para diminuir o rotor depois de spinning.
4. Transferir os CTLs para um novo tubo de 15 mL cônico. Adicionar HBSS a um volume de aproximadamente 10 mL de lavar.
5. Contagem das células. Girar a 1300 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente. Ressuspender em HBSS com a densidade de células necessárias para injeções, mantendo o volume total por injeção de 100 mL.
6. Use a técnica de injecção mesma cauda como visto anteriormente neste vídeo para injetar o CTLs em camundongos portadores de tumor.
7. Devolver o mouse para a gaiola, e permitir que o CTLs para interagir com o tumor. Camundongos são geralmente sacrificados para análise 14-21 dias após o tratamento CTL.

3. Visualização de metástases pulmonares

1. Para visualizar metástases pulmonares, coloque um rato sacrificado em sua parte traseira em uma placa de isopor. Pinos nas pernas para garantir livre acesso à traquéia. Pulverizar o lado ventral com etanol 70%.
2. A partir de meados da década de abdômen, use uma tesoura para cortar ao longo da linha média, através da caixa torácica, e até para as glândulas salivares. Expor a traquéia. Use uma pinça para remover os tecidos em torno da traquéia.
3. Um fio de 200 mL ponteira debaixo da traquéia. Segurando a ponta com uma mão, levante suavemente a traqueia para cima e longe do corpo.
4. Gire a plataforma de 180 °. Use uma seringa de 50 ml para injetar tinta da Índia para os pulmões através da traquéia. Completamente inflar os pulmões com tinta até sentir uma forte resistência.
5. Use uma tesoura para cortar a traquéia. Deslize um par de fórceps sob os pulmões e tirá-los do mouse. Enxágüe os pulmões brevemente em um Copo de 1 litro de água.
6. Em uma Cobertura de vapores químicos, a transferência dos pulmões para um frasco de cintilação de vidro contendo 5 mL de solução de Fekete. O tecido do tumor irá emergir como nódulos brancos sobre os pulmões pretos depois de alguns minutos. Os tumores podem ser contados e armazenados em solução Fekete indefinidamente.

4. Metástases representante em Pulmões visualizada

1. Aqui, os pulmões de ratos que foram injetados com carcinoma mamário 4T1 linha celular mostram manchas brancas indicando tumores. Ratos que foram injetados com células 4T1 transfectadas com uma IRF8 K79E dominante negativo do mutante mostrar o potencial metastático maior de células tumorais.
2. Estas imagens mostram uma análise histológica da eficácia da imunoterapia transferência CTL adotivos. Tumor-rolamento camundongos injetados com solução salina mostrou tumores múltiplos seis dias mais tarde, indicado por setas amarelas (A). Camundongos injetados com células tumorais específicas T, por outro lado, mostrou uma redução de tumores (B).
3. No mesmo experimento, Índia tratamento de tinta dá um jeito mais simples para medir a eficácia da transferência adotiva CTL. Aqui, os nódulos tumorais branco sobre portadores de tumor nos pulmões claramente distingui-los dos pulmões, que têm sido submetidos com sucesso a transferência adotiva CTL, e contando os nódulos permite um graude quantificação não é possível com a histologia.

5. Resultados representante

Figura 1. Esquema experimental para a metástase do tumor experimental e CTL transferência adaptativa modelo de camundongo imunoterapia. Pontos vermelhos indicam as células tumorais e pontos verdes indicam CTLs.

Figura 2. Rompimento de IRF8 função aumentaram o potencial metastático das células tumorais. Rato carcinoma mamário 4T1 linhagem de células foi estavelmente transfectadas com vetor (4T1.Vector) ou vector expressar uma IRF8 dominante negativo do mutante K79E (4T1.IRF8K79E) (15, 16). Células tumorais foram injetadas nas veias da cauda iv do mouse lateral. Tumor-rolamento pulmões foram inflados com tinta nanquim para visualizar nódulos tumorais. Nódulos tumorais são facilmente vistos como manchas brancas sobre o fundo preto do tecido pulmonar.

Figura 3. A análise histológica da eficácia da imunoterapia transferência CTL adotivos. Rato linha celular sarcoma CMS4-Met foi injetado nas veias do mouse iv laterais da cauda. Três dias depois, salina (A) ou células tumorais específicas T (B) foram injetadas em camundongos portadores de tumor. Pulmões foram analisados ​​seis dias após o tratamento CTL pela coloração H & E convencionais histológica. Nódulos tumorais são indicados por setas.

Figura 4. Visualização de nódulos tumorais pela Índia inflação de tinta. Rato linha celular sarcoma CMS4-Met foi injetado nas veias do mouse iv laterais da cauda. Três dias depois, salina (controle) ou células tumorais específicas T (CTL +) foram injetadas em camundongos portadores de tumor. Pulmões foram analisados ​​14 dias após o tratamento CTL. As manchas brancas, que são nódulos tumorais, permitem a quantificação fácil da eficácia do tratamento CTL.

Materials

Solutions:

India Ink Solution (17):

Pour 150 ml of distilled water into a 250 ml flask. Add 4 drops ammonium hydroxide to the distilled water. Add 30 ml India Ink stock (i.e. Sanford Black Magic Waterproof Drawing Ink 4465 Item 44011) to the ammonia and water mixture. Top off with distilled water to a volume of 200 ml. Solution is ready for injection.

Fekete's Solution (17):

Fekete's solution is used to bleach India ink-inflated tumor-bearing lungs to distinguish white tumor nodules from the black background of normal tissues.

Add 350ml 95% EtOH to 1L glass bottle. Add 150ml distilled water Add 50ml formaldehyde Add 25ml glacial acidic acid