Generación de ADN / ARN híbridos en el ADN genómico de transformación utilizando oligonucleótidos de ARN que contiene

Summary

Este trabajo muestra cómo se forma un híbrido ADN / ARN a nivel cromosómico y revelar la transferencia de información genética de ARN a ADN genómico en células de levadura.

Abstract

Polímeros sintéticos cortos de ácidos nucleicos, oligonucleótidos (oligos), son las herramientas más funcionales y generalizada de la biología molecular. Oligos se puede producir para contener ADN o ARN deseado secuencia y se puede preparar para incluir una amplia variedad de base y las modificaciones de azúcar. Por otra parte, oligos pueden ser diseñados para imitar las alteraciones específicas de ácidos nucleicos y por lo tanto, puede servir como una herramienta importante para investigar los efectos de daño en el ADN y los mecanismos de reparación. Hemos encontrado que Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligos con una longitud de entre 50 y 80 nucleótidos pueden ser particularmente adecuado para estudiar, en vivo, funciones y consecuencias de ARN cromosómico / híbridos de ADN y de ribonucleótidos incrustado en el ADN. ADN / ARN de los híbridos puede formar fácilmente durante la replicación del ADN, la reparación y transcripción, sin embargo, se sabe muy poco sobre la estabilidad del ADN / ARN de los híbridos en las células y en qué medida estos híbridos pueden afectar a la integridad genética de las células. Que contienen ARN oligos, por lo tanto, representan un vector ideal para introducir ribonucleótidos en el ADN cromosómico y generar ADN / ARN de los híbridos de longitud elegida y la composición de bases. Aquí se presenta el protocolo para la incorporación de ribonucleótidos en el genoma de la levadura modelo de sistema eucariota / Saccharomyces cerevisiae /. Sin embargo, nuestro laboratorio ha utilizado Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligos para generar ADN / ARN de los híbridos a nivel cromosómico en los sistemas de células diferentes, desde las bacterias a las células humanas.

Protocol

Razón fundamental

Explotar el uso de Thermo Scientific Dharmacon oligos, del 50 al 80-mers, aquí se presenta un procedimiento, basado en un ensayo de la corrección de genes, por lo que oligos puede transferir la información genética en el ADN genómico de células de levadura, después de recocido para la meta de ADN cromosómico. El éxito de la orientación por oligos se califica por la aparición de colonias de levaduras que muestra el fenotipo esperado. Si la modificación genética deseada se realiza en una o más ribonucleótidos incorporado en la secuencia oligo, la información genética fluye directamente de las vías de ARN para la meta de ADN cromosómico, por lo tanto, una forma de ARN / ADN híbrido en el nivel de los cromosomas durante el proceso de selección. La ribonucleótido / s de un Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligo puede servir como plantilla para la orientación de genes a través de la síntesis de reparación del ADN o se puede integrar en el ADN y servir como plantilla durante la replicación del ADN. En estos experimentos se utiliza la levadura / Saccharomyces cerevisiae / modelo de sistema eucariota, sin embargo, un enfoque similar puede aplicarse también en otros organismos o tipos de células. En este vídeo, se utiliza un Thermo Scientific Dharmacon oligo diseñado con homología a un lugar de destino genómico de levadura y contiene un ribonucleótido en el medio para corregir una mutación en el gen diana. Después de la transformación con el oligo contiene ARN, se observa la corrección de la página dirigida a una determinada frecuencia, lo que indica que las vías de ARN del oligo podrían ser incorporados en el ADN cromosómico y servir como molde para la síntesis de ADN durante la replicación del ADN. La información genética dentro de la zona de ARN es estable transmitido a las generaciones siguientes de células. A continuación se describen los pasos de la transformación de células de levadura por la Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligo y el enfoque para detectar la información de la transferencia de ARN en el ADN cromosómico.

A. Diseño de la Oligo que contiene ARN utilizado en este experimento

Hemos diseñado un oligo que contienen ARN para corregir un defecto genético en la levadura S. cerevisiae ADN cromosómico en el locus trp5. La cepa de levadura utilizada en el protocolo contiene un gen mutante trp5 con una deleción de dos bases y una mutación sin sentido (Figura 1). Cepa de levadura como es un mutante auxotróficos triptófano y no forma colonias en los medios de comunicación sin triptófano. La secuencia de ADN del gen TRP5 está disponible en la Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/). El Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligo utilizado en este protocolo es un 65-mer con una inserción de ADN de dos-base, diseñado para corregir la mutación por deleción y un ribonucleótido diseñado para corregir la mutación sin sentido del alelo trp5 (Figura 1). La secuencia del oligo está diseñado de la siguiente manera:
5'-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-RG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Este oligo es sintetizada por Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) en la escala de 200 nm, y desalado es, desprotegido y utilizado sin purificación PÁGINA.

B. Preparación del Oligo que contiene ARN para la Transformación de la levadura (modificado de Storici et al., 2007 ¹⁾

1. Limpie los materiales que serán utilizados para el experimento, con tubos de oligo, pipetas, vórtice, bastidores, área experimental y guantes usados ​​por el investigador con la solución de descontaminación RNasa para eliminar la contaminación potencial de RNasa antes de que comience todo. Use agua libre de RNasa, reactivos químicos, tubos y pipetas de todos los pasos. Cada paso en este experimento debe ser libre de RNasa.
2. Resuspender el Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligo recibido de la empresa a 250 pmoles / l de solución madre con agua libre de RNasa y agitar vigorosamente para disolver el precipitado. Almacenar a -80 ° C.
3. Inmediatamente antes de la transformación, descongelar el oligo contienen ARN en el hielo y se diluye a 50 pmoles / ml con agua libre de RNasa en RNasa libre de los tubos. Cada transformación requiere un nmol de los oligos que contienen ARN.
4. Desnaturalizar una cantidad elegida de los oligos que contienen ARN en el bloque 100 ° C de calor durante 2 minutos para eliminar las estructuras secundarias de los oligos.
5. Inmediatamente después de la desnaturalización se coloca el tubo en hielo. Mantener en hielo hasta la transformación.
6. Como el control en el experimento de un ADN único correspondiente oligo se utiliza. Este oligo se descongela de -20 ° C y se preparó para la transformación de los oligo-ARN que contienen, como se describió anteriormente.

C. La transformación de células de levadura con el Oligo que contiene ARN

1. Inocular 5 ml de medio rico líquido YPD con la trp5 células de levadura mutante y crecer a 30 ° C durante la noche (ver Materiales).
2. La transferencia de 1,5 ml del cultivo de una noche en 50 ml de medio líquido YPD.
3. Se incuban las células en un agitador de 30 ° C (225 rpm) durante 4 horas.
4. Prepare la solución de uny Solución 2 inmediatamente antes de la transformación en RNasa libre de los tubos (ver Materiales).
5. Transferir el cultivo de células a un 50 ml RNasa libre de tubo y giran a 3000 rpm, lo que corresponde a 1.562 g, durante 2 minutos. El pellet de células de la precipitación es de aprox. 0.3 cm ^3.
6. Eliminar las células sobrenadante y lavar con 50 ml de agua libre de RNasa y giran a 3000 rpm durante 2 min.
7. Repita el paso 6 por 5 veces para deshacerse del medio de cultivo y RNasas que podrían estar presentes en el medio tanto como sea posible.
8. Retire el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml de la solución 1 y giran a 3000 rpm durante 2 min.
9. Eliminar las células sobrenadante y resuspender en 250 l de Solución 1. Esta cantidad de células es suficiente para 7-8 transformaciones.
10. Alícuota de 50 l de la suspensión celular en tubos de microcentrífuga de RNasa libre, se añaden 20 l de ARN que contiene la solución oligo de trabajo (1 nmol), o 20 l de ADN oligo única solución de trabajo (1 nmol), o 20 l de agua estéril sin oligo para el control negativo. A continuación, añadir 300 l de solución de 2 por cada reacción de transformación. No hay necesidad de añadir ADN de esperma de salmón en el proceso de transformación, como la Ley de oligos como portador de sí mismos.
11. Agitar vigorosamente para mezclar componentes de forma homogénea.
12. Incubar las reacciones de transformación a 30 ° C durante 30 minutos en una coctelera.
13. De choque térmico a 42 ° C durante 15 min.
14. Centrifugar las células a 5000 rpm, lo que corresponde a 2.236 g, durante 4 minutos.
15. Eliminar las células sobrenadante y resuspender en 100 l de agua estéril.
16. Tomar una alícuota de esta suspensión celular y se diluye con agua estéril de 100.000 veces y células de la placa en una placa de YPD con aprox. 15 perlas de vidrio estéril y se incuba a 30 ° C durante 2 días.
17. Placa de todas las células se resuspendieron en cada reacción de transformación de una placa de Petri de medio completo sintético sólido sin triptófano (SC-Trp) con aprox. 15 perlas de vidrio estéril y se incuba a 30 ° C durante 4-5 días (Figura 2).

D. Análisis de la corrección de genes por el ARN que contienen Oligo

1. Cuente el número de colonias crecidas en el medio selectivo (Figura 2), así como en medio YPD para calcular la frecuencia de corrección de genes para la oligo contienen ARN, el ADN oligo-y sólo para el control de no-oligo. Compare el número obtenido. La tasa de reversión espontánea de la trp5 alelos con la supresión de dos bases y la mutación sin sentido es inferior a 9.10 en la cepa de levadura que se usa, por lo tanto no esperamos la formación de colonias en el medio selectivo cuando no oligos se añaden a las células.
2. Racha de varias colonias transformantes seleccionados al azar en medio YPD para obtener aislados de una sola colonia. Esperar dos días para el crecimiento de la colonia, luego tomar varias (al menos 5) colonias aisladas y hacer parches en YPD y en medio selectivo.
3. Diseño de un par de cebadores para amplificar la región (250-1,000 pb) dirigido por el oligo contienen ARN por PCR colonia (fig. 1B). El procedimiento para la colonia PCR es la siguiente (modificado de Storici y Resnick, 2006 ^2).
   1. Suspender las células (aproximadamente 1 mm3) tomadas de los parches individuales en 50 l de agua y añadir una unidad de liticasa. Incube a temperatura ambiente durante 10 minutos, seguido de incubación en un bloque térmico a 100 º C durante 5 minutos para romper las células y el ADN genómico de la liberación en la solución.
   2. Las condiciones de PCR: La reacción de PCR incluye 10 l de la solución de resuspensión celular, 50 pmoles de cada uno de adelante y atrás, 1 l de 10 mM dNTPs, 1 unidad de Taq polimerasa, 5 l de tampón 10x y se ajusta con agua estéril a una volumen final de 50 ul. El programa de PCR es de 3 min a 95 ° C, 30 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s, a 55 ° C y 1 min a 72 ° C, un tiempo de extensión final de 7 min a 72 ° C, a continuación, las muestras se mantienen a 4 ° C. Una ampliación de tiempo de 1 min / kb se supone para esta reacción.
   3. Tras la PCR, las muestras se ejecutan en un 1% o 2% (dependiendo del tamaño esperado del producto de PCR) en gel de agarosa para la observación del producto de PCR (Figura 3).
4. Si la información genética transferida por el oligo contienen ARN genera un nuevo sitio de restricción en la región de la levadura objetivo genómica (fig. 1B), es posible verificar la correcta transferencia de información por parte de la digestión del producto de PCR con la enzima de restricción apropiada. Si no hay ningún sitio de restricción es generado por el oligo contiene ARN, vaya al paso 6. Digerir los productos PCR utilizando una enzima de restricción específica. La reacción de digestión con 6 l de producto de PCR, buffer, BSA (puede no ser necesario para algunas enzimas, consulte las instrucciones de la enzima que se utiliza), 0,5 l de enzima de restricción, y agua estéril a 15 microlitros. Las muestras se incuban durante 1 hora a la temperatura específica de la enzima utilizada.
5. Ejecutar una muestra no digerida, junto con las muestras digeridas en la misma fila de un 2% en gel de agarosa alobservar la modificación genética transferida por las vías de ARN del oligo que contienen ARN (Figura 3).
6. Purificar productos de PCR utilizando un kit de purificación de PCR y prepararlos para la secuenciación del ADN. Enviar muestras para secuenciar con los mismos cebadores utilizados para amplificar el producto.
7. Analizar los resultados de la secuenciación del ADN mediante un software que permite la alineación de secuencias múltiples con una secuencia de referencia elegido (Figura 4).

E. alcalinos Tratamiento de la oligo que contienen ARN (Figura 5)

1. Para cada reacción, se añade 1 nmol (4 l de 250 pmoles / l de solución madre) de los oligo contienen ARN o ADN oligo-en un tubo de 1.5 ml.
2. Agregar 4 l de NaOH 1 M para la hidrólisis, o bien añadir 4 l H ₂ O como control negativo, y se incuba a 65 ° C en un baño de agua durante 1 h. A continuación, pasar de un baño de agua a hielo.
3. Neutralizar con 2 l de 1,2 M de HCl, 4 l de 1 l M Tris-HCl, y 4 de H ₂ O, o, alternativamente, 6 l de H ₂ O y 4 l de 1 M Tris-HCl de control negativo. Mantener en hielo hasta la transformación.

Figura 1. Diagrama esquemático de la defectuosa trp5 gen y del alelo TRP5 corregido por el oligo contienen ARN. A) El gen mutante trp5 contiene una deleción de dos-base (triángulos en negro) y una base de mutación sin sentido (asterisco). La única cadena de ARN que contiene oligo con la inserción de dos-base (azul bucle) y 1-ARN sustitución de base (rectángulo rojo) que genera un sitio Van91 I enzima de restricción (mostrado por el soporte) se transforma en células de levadura para corregir los defectos genéticos del gen trp5. B) Después de que el gen TRP5 es reparado por el oligo que contienen ARN (bases corregido se indican como rectángulos azules), el sitio Van91 que se genera en el gen TRP5. Un fragmento de 278 pb incluyendo sólo una Van91 sitio de restricción que en TRP5 gen está amplificado por PCR con un par de primers (P1 y P2). El 177 pb y 101 pb fragmentos generados tras la digestión de la P1 y P2 de productos PCR por Van91 que también se muestran.

Figura 2. Resultado de la transformación con el oligo contienen ARN. A) Las células de levadura transformadas sin oligo no forman colonias en el medio SC-Trp, ver las placas AB. B) Las placas cg colonias de levadura muestran cada vez mayor en SC-Trp después que las células se transforman con un nmol de la oligo contienen ARN. C) Las placas hl colonias de levadura muestran cada vez mayor en SC-Trp después que las células se transforman con un nmol de la ADN-sólo oligo correspondiente control.

Figura 3. La detección de la transferencia de información genética del ARN que contiene oligo de ADN cromosómico de levadura por restricción de la digestión del producto de PCR amplifica la región genómica específica. 2% electroforesis en gel de agarosa de las muestras de PCR amplificado por P1 y P2 y se digiere con enzimas de restricción que Van91. Las calles 1, 8 y 15, escalera de ADN con tamaños de 100, 200, 300, 400 y 500 pb indica a la izquierda, calle 2, producto de PCR de trp5 lugar amplificado a partir del ADN genómico de la cepa mutante trp5, calle 3, PCR producto amplificado de ADN genómico derivados de una colonia Trp + dirigida por el oligo de ADN de sólo carril de 7.4, los productos de amplificación de PCR de ADN genómico derivados de Trp + colonias dirigidas por el oligo contiene ARN, calle 9 y 14 años, Van91 I restricción de la digestión de los productos PCR de los carriles de 2 a 7. La presencia de las bandas de los productos en bruto de PCR en los carriles de 10 a 14 se puede explicar por digestión parcial por Van91 I en el locus TRP5 (CCACATTCTGG). Teniendo en cuenta que el sitio de corte para Van91 I (CCANNNN NTGG) puede tener varias secuencias, el sitio genera en TRP5 no puede ser el objetivo más óptimo para la enzima. De hecho, el ADN después de la secuenciación de todo lo anterior, los productos de PCR se detecta ningún cambio adicional más allá de las realizadas por los oligos (ver Figura 4). Los 278 puntos básicos la banda de amplificación de PCR por P1 y P2 cebadores y las bandas de producto de digestión por Van91 I de 177 pb y 101 se muestran las flechas a la derecha.

Figura 4. Resultados de la secuenciación de ADN que muestran la corrección de genes por el ARN oligo-que contiene. A electroferograma ADN) de la región genómica orientada por el oligo contienen ARN. El G en la secuencia de ADN (en azul en caja) se deriva de la RG en el oligo contienen ARN. También en caja es la inserción de las bases CG. Resultados de la secuenciación de todos los demás productos de la PCR son también como CLEar como éste, con señales fluorescentes muy por encima del fondo. B) Las secuencias de la región TRP5 del Trp + transformantes dirigido por el oligo de ADN sólo (T1) y el oligo que contienen ARN (T2-T5) coinciden en la secuencia de consenso en la parte superior y se comparan con el de la trp5 células mutantes antes de la orientación por los oligos (ADN genómico, de color rojo con fondo gris). La reparación de ARN que contiene oligo en la parte inferior tiene dos base de la inserción del ADN y una base (G) la sustitución de ARN marcados en rojo. Las regiones en caja de color azul con la demostración de que el tono amarillo que contienen ARN oligo, así como el oligo de ADN sólo se corrige con precisión la mutación y la eliminación de mutación sin sentido en todas las muestras analizadas. Las líneas de puntos marcan la posición de la secuencia de ARN que contiene oligo.

Figura 5. Tratamiento alcalino impide la corrección de genes por el ARN oligo-que contiene. La frecuencia de transformación por el oligo que contienen ARN (R) se muestra en la barra roja y que por el oligo de ADN sólo (D) se muestra en las barras azules. Las barras de error representan el error estándar de la media de tres transformaciones independientes para cada oligo. El ADN sólo se muestra la frecuencia oligo transformación similar con y sin tratamiento con NaOH. De otra manera, la frecuencia de transformación por el oligo contienen ARN cae a 0 tras el tratamiento con NaOH. Por lo tanto, la preparación con el oligo contienen ARN no está contaminado con ADN de sólo oligo, por lo tanto, la frecuencia de la transformación observada es específica para el oligo contienen ARN.

Discussion

El hecho de que el ARN puede transferir la información genética directamente al ADN genómico de las células fue descubierto explotar el uso de sintéticos que contienen ARN oligos (oligos Dharmacon sintetizado) ^1. Era la prueba de principio de que las células pueden utilizar el ARN que contienen moléculas o secuencias de ARN-sólo como plantillas para la síntesis de ADN. El uso de ARN que contienen oligos no sólo condujo a la demostración de que la información genética se pueden transferir directamente a partir de ARN a ADN genómico sin la necesidad de una transcripción reversa de copias de ADN intermedios, sino también a la prueba de que el ARN puede ser utilizado como homóloga plantilla en la reparación de un daño en el ADN ^1,3. Los oligos se puede hacer de ARN o de sólo contienen sólo un ribonucleótido único incrustado en una secuencia de ADN, como en el ejemplo que presentamos aquí. El oligo contienen ARN tiene un ribonucleótido código diseñado para corregir la mutación sin sentido en el genoma defectuoso trp5 alelo. La transferencia de información genética de la ribonucleótido en el ADN genómico se pone de manifiesto por un cambio en el fenotipo (células que crecen en el medio carecen de triptófano) de las células afectadas. La frecuencia de la corrección de genes obtenidos con el oligo que contienen ARN se mide y compara con la de un ADN de sólo el control oligo. Mediante la realización de este ensayo la corrección de genes en células diferentes orígenes, en la que mutan los genes de diferentes hongos, que puede detectar qué factor / s afectan específicamente a la orientación por los oligos que contienen ARN. Por lo tanto, puede revelar los mecanismos de cómo las células regulan la estabilidad del ADN / ARN de los híbridos. Simplemente el diseño de las diferentes variantes de los oligos que contienen ARN se puede determinar la probabilidad de una determinada zona de ARN para servir como modelo en la modificación del ADN y podemos determinar la estabilidad de las secuencias específicas de ARN incrustado en el ADN. Por otra parte, podemos identificar cuáles son las preferidas en los sustratos in vivo de factores que interactúan con el RNA / híbridos de ADN.

Mientras que varios estudios in vitro, sobre todo la utilización de ARN corto oligos que contienen, se han realizado para caracterizar la función de los factores que pueden reconocer el ARN en un híbrido con el ADN, como las enzimas RNasa H ^4, en funciones in vivo de RNasas H, así como la identidad de otras proteínas que podrían afectar ADN / ARN estabilidad híbridos siguen siendo en su mayoría desconocidos. La posibilidad de utilizar que contiene ARN oligos de una longitud considerable (50 a 80-meros) y una calidad óptima (por ejemplo, Thermo Scientific Dharmacon contienen ARN oligos) ha abierto el camino para examinar una amplia gama de procesos moleculares in vivo directamente en el las células de interés. Como se muestra en este video, con la transformación que contienen ARN oligos requiere esencialmente a sólo unos pasos adicionales en comparación con la transformación con las moléculas de ADN, para evitar la degradación por ARNasas. Por lo tanto, la transformación utilizando ARN que contienen oligos no se limita al sistema de la levadura, pero se puede aplicar a cualquier organismo o tipo de célula donde la transformación de ADN oligos es competente.

En conclusión, por atacar a las células que contienen ARN oligos ofrece la oportunidad de generar híbridos de ADN / ARN y ribonucleótidos incrustado en el ADN in vivo en las células. La estabilidad, la función y sus consecuencias en vivo genera ARN / ADN híbridos pueden ser analizadas y caracterizadas, lo que podría revelar mecanismos desconocidos de reparación del ADN y revelando nuevas estrategias para la manipulación genética.

Materials

A. Transformation reagents and media (modified from Storici and Resnick, 2006

YPD (Yeast Peptone Dextrose): For 1 L, 10 g yeast extract, 20 g soy peptone, 20 g dextrose. Add 15 g agar to make YPD solid media. Autoclave before use. Store at room temperature. Solution 1: 0.1 M of lithium acetate. Prepare immediately before transformation. Solution 1 is a working solution, thus it is prepared directly from the powder. No stock solution is made. Keep at room temperature. LiAc increases the yeast cell wall permeability to DNA. Solution 2: 0.1 M of lithium acetate and 50 % of polyethylene glycol 4000. Also solution 2 is a working solution and it is made directly from the powder. No stock solution is prepared. Keep at room temperature. PEG deposits oligos onto yeast cells. RNA-containing oligos (Thermo Scientific Dharmacon), 50-80-mers, desalted, deprotected and non-purified. Resuspend to 250 pmoles/μl. Store at -80 °C. DNA-only oligos, 50-80-mers, desalted and non-purified. Resuspend to 50 pmoles/μl. Store at -20 °C. SC-Trp (Synthetic complete media lacking tryptophan) solid media. 0.5 cm diameter glass beads, sterilized by autoclaving. RNase-off: RNase decontamination solution. DNase/RNase-free, sterile centrifuge tubes. DNase/RNase-free, sterile conical tubes. DNase/RNase-free, sterile aerosol pipette tips with ZAP: 1-200 ml, 100-1000 ml.

B. Colony PCR materials.

DNA primers, desalted and non-purified. Dissolve in sterile water to 50 pmoles/μl. Store at -20 °C. Taq DNA polymerase, buffer, dNTPs. PCR tubes.

C. PCR purification.

PCR purification kit.

D. Gel Electrophoresis.

Agarose. 1 x TBE running buffer (45 mM Tris-borate and 1 mM ethylenediamine tetraacetate) diluted from 10x TBE. Prestained molecular weight marker. DNA loading dye.

E. Restriction digestion.

Restriction enzymes, 10x buffers, BSA.

F. Alkali treatment for the RNA-containing oligo.

1 M of NaOH solution. 1.2 M of HCl solution. 1 M of Tris-HCl, pH 7.4 solution.