Summary
Bu video floxed Rac1 allel taşıyan birincil fare embriyonik fibroblastlar bulaştırmak için Cre recombinase gen taşıyan bir adenovirüs kullanın.
Abstract
Genetik olarak çeşitli hücre sinyalizasyon kaskadlar belirli bileşenleri kaldırmak için modern sinyal iletimi analizi yeteneği ayrılmaz bir araç olmuştur. Cre-loxP sisteminin kullanımı yoluyla bu koşullu silme işlemini gerçekleştirmek için özel bir yöntem. Bu yöntem ile ilgi gen Cre recombinase protein için özel tanıma dizileri loxP siteleri, yan içerir. Sözde floxed (loxP sitesi ile çevrili) DNA Cre-aracılı bir rekombinasyon loxP siteleri olay ve müdahale gen 3 sonraki eksizyonu bu enzim sonuçlarına maruz kalması. Cre recombinase ilgi site yönetmek için birkaç farklı yöntem bulunmaktadır. Bu video, floxed Rac1 allel 1 içeren embriyolar elde edilen birincil fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) bulaştırmak için Cre recombinase gen içeren bir adenovirüs kullanımını göstermektedir. Deneyler için Rac1 MEFS seçimi için gerekçe bu aktin hücre iskeletinin 2,5 değişiklikler nedeniyle Rac1 silinmesi, üzerine belirgin morfolojik değişiklikler görülebilmektedir. Viral iletimi ve Cre ifade takiben 72 saat, hücreleri aktin boya Phalloidin kullanılarak boyandı ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak görüntülü edildi. Adeno-Cre virüsüne maruz kalmış MEFS, enfekte olmamış hücrelere oranla daha önceki raporlarda 2,5 tutarlı sözleşmeli ve morfolojisinde uzatılmış ortaya çıktığını gözlendi. Cre recombinase teslim adenovirüs yöntem adeno-Cre virüs kolaylıkla ulaşılabilir olduğu gibi avantajlı ve hücrelerin yaklaşık% 100 Cre yoluyla gen delesyonu optimize edilmiş adenoviral enfeksiyonu ile elde edilebilir.
Protocol
Çözülme hücreleri
- Sıvı azot donmuş fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) (bireysel embriyo primer kültürlerden gelen, daha önce oluşturulan) alın.
- 37 flakon çeker çözülme hücreleri ° C su içeriğini tamamen çözülmüş kadar dönen.
- 10cm hücre kültürü plakası% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiştir DMEM 9ml ekleyin.
- Plaka açılan akıllıca çözülmüş hücre süspansiyonu ekleyin, 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatör gecede hücrelerin ve dağıtmak için yer plaka plaka hafifçe sallayın. Hücreleri DMSO (donma süreci) duyarlı hücreleri (yaklaşık dört saat sonra kaplama) plaka yapıştırılır sonra, ilk medya taze medya ile değiştirilmesi olduğunu unutmayın. Ayrıca çözülme sonrasında bu hücrelerin izdiham dikkat donmuş hücreleri sayısı bağlıdır, hücrelerin dondurulması sonra iyileşme oranı ve hücrelerin büyüme oranı.
Pasajlanması hücreleri
- Hücreleri confluency aslında% 100 (yani: ertesi gün) büyüdü, medya aspirat steril PBS 5ml ile hücre yıkayın.
- PBS çıkarın ve yaklaşık 5 dakika için inkübatör 10mM EDTA yeri ve plakası içeren 1 ml tripsin eklemek, hücreleri plaka ayırmak için izin verecek.
- Hücreleri müstakil, tripsinize hücreleri kümeleri dağıtmak, medya 9ml içeren yeni bir plaka üzerine açılan bilge bu süspansiyon 1mL eklemek, ve bu yerde 37 ° C inkübatör gecede medya 9ml eklemek, pipet 2-3 kez . Alternatif medya FBS varlığı tripsin inaktive, hücreler tripsin sulandırmak için ilk yıkanmış olabilir.
Kapak fişleri üzerine hücrelerinin sayımı ve kaplama
- Inkübatör gelen hücreleri çıkarmak, bu sefer yerine 9ml tripsinize hücreleri 5-6mL ortam eklemek dışında, yıkama ve daha önce olduğu gibi trypsinize.
- Pipet hücreleri tek bir hücre süspansiyonu iyice içine tam ayrılma sağlamak ve ayrı bir mikrofuge'de boru tripan mavi 15μL ile birleştirmek için 15μL kaldırmak.
- Bu hücre / tripan mavisi süspansiyon birkaç kez aşağı yukarı pipetleme Mix ve hemasitometre 15μL ekleyin.
- Mikroskop altında, ölü hücreleri mavi görünecektir. Hemasitometre 4X4 ızgaraları birinde renksiz / clear (yaşam) hücrelerinin sayısını. Diğer üç 4X4 ızgaraları (gösterilir A, B, C ve D) Bu sayımı tekrarlayın ve süspansiyon mcL başına hücre sayısını hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:
- Protokol optimizasyonu sayesinde, deney sonuca görünüm için uygun hücre yoğunluğu 30.000 hücreleri sonuçları kaplama olduğunu tespit ettik.
- 30.000 hücreleri için gerekli olan hücre süspansiyonu hacmini hesaplamak için, aşağıdaki denklemi kullanın:
- Şimdi altı sıra çanak her bir kuyunun içine steril bir cam kapak kayma yeri ve her iyi medya 2mL eklemek ve ardından hücre süspansiyonu hacmi 30.000 hücreleri için gerekli olan her bir kuyunun içine açılan bilge eklemek. Biz daha sonraki bir zaman noktasında floresan mikroskobu kullanarak hücrelerin görselleştirme olacak gibi, bu deney için kullanılan cam kapak fişleri olduğunu unutmayın; tüm uygulamalar mutlaka mikroskopi gerektirir ve böylece fişleri gerekli olmayabilir kapsayacak.
Virüs İletimi
- Birkaç saat veya gece boyunca (hücrelerin kapak fişleri uymasını sağlamak için yeterli bir süre) sonra, medyayı çıkartın ve 1 ml serum serbest DMEM hücreleri yıkayın.
- Ayrıca virüs için her bir kuyu için 1 ml serum ücretsiz medya ekleyin. Bu deneme için, adeno-Cre virüs vektör Biolabs ticari olarak elde edilmiştir.
- Önceki protokol optimizasyonu 500 enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) birincil MEFS hücre canlılığı çok az veya hiç etkisi ile yüksek verimli gen transdüksiyonu sağladığını göstermiştir. İçişleri Bakanlığı aşağıdaki gibi hesaplanacaktır:
- Enfekte olduğu her iyi virüs doğrudan hesaplanan hacim ekleme, plaka gecede 37 ° C inkübatör içine virüs ve yer hücrelerini dağıtmak için hafifçe sallayın.
- Ertesi sabah, kaldırmak için virüs içeren hücreler medya ve 1ml steril PBS içinde hücre yıkayın ve sonra her bir kuyu için düzenli medya 2mL eklemek.
- Bu deneyde örneklediği Rac1 hücrelerinin durumda, yaklaşık 72 saat sonrası transdüksiyon hücreleri morfolojik değişiklikler meydana geldi.
Temsilcisi Sonuçlar
Hücreler görselleştirmek edildid aktin boya Phalloidin (sadece görüntüleme amaçları için) boyama ve Guelph Üniversitesi İleri Analiz Merkezi Leica TCS-SP5 multiphoton konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak görüntülü. Şekil 1, virüsü değil, aynı hücrelere göre adeno-Cre virüse maruz Rac1 Flox / Flox hücreleri sözleşmeli ve uzamış morfolojisi gösterir .
Şekil 1 (sağda) aynı kaynaktan enfekte olmamış hücrelerdeki göre adeno-Cre virüsü (solda) ile enfekte Rac1 Flox / Flox hücreleri arasındaki karşılaştırma.
Discussion
İlişikteki video rekombinant virüs Cre recombinase kullanarak in vitro tüketim belirli bir gen nasıl kullanılabileceğini örnek teşkil etmektedir. Ancak bu protokolün geliştirilmesi ele değer bazı belirli noktaları ortaya yaptı.
- Adenovirüs ile çalışırken uygun güvenlik prosedürleri, her zaman kullanılmalıdır. Virüs ile çalışırken her zaman bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giyilmelidir. Medya ve plastik eşya, en az 30 dakika süreyle% 10 oranında çamaşır suyu ile tedavi edilmelidir ve plastik eşya bundan sonra otoklava olmalıdır.
- Kaçının tekrarlanan donma-çözülme, bu virüs titresi etkileyebilir ve böylece transdüksiyon etkinliğini azaltmak gibi virüs stokunun. Küçük miktarda virüs stokunun başlangıçta ayrı tüpler içine aliquoted olmalıdır.
- 50-500 gelen değişen Mois yöntemi geliştirme sırasında test edildi ve verimli transdüksiyon oranları hücre canlılığı üzerine olumsuz etkileri olmadan, çoğu durumda gözlendi.
- Adeno-GFP transdüksiyon verimlilikleri hızla ekrana yöntem geliştirme sırasında kullanıldı. Bu kontrol (veya boş bir vektör), hücresel değişikliklere neden olmaz sadece bu viral enfeksiyon sağlamak için deney sırasında yapılmalıdır. Aynı şekilde, hücrelerde ilgi floxed gen eksize herhangi bir hücresel değişiklikler (yani morfoloji veya canlılığı değişiklikler) neden değilse, o zaman adeno-GFP ile aynı hücre tipi bulaşmasını virüs transdüksiyon göstermek için kullanmak önemli bir kontrol meydana gelen.
Kültür kaskadlar sinyalizasyon inceleme ötesinde, adeno-Cre yaklaşımı da, deney hayvanları 3,4 genler koşullu kaldırın ve 6 içinde bir organizmanın hücreleri belirli toplumlarda etiket in vivo olarak istihdam edilmiştir . Konak hücre içine Cre recombinase başka genlerin de tanıtmak için adenovirüs sistemi adapte edilebilir. Bu teslim vektör kullanarak iki temel avantajı, yüksek iletimi ve gen teslim verimliliği ve konak DNA ile entegrasyon eksikliği. Ancak, yeni rekombinant adenovirüs nesil Emek yoğun olabilir. Burada açıklanan protokol bu nedenle daha önce geliştirilen adeno-Cre virüs istismar adenoviral sistemi gücünü sürdürür ve kaplin faiz, Rac1 floxed allel. Bu deney koşullu vuruş sayesinde, MEFS floxed Rac1 allel taşıyan adeno-Cre virüs kullanarak transdüksiyon gerçekten Rac1 eksikliği hücreleri 2,5 hücresel morfoloji karakteristik değişiklikleri önde gelen Rac1 eksizyonu neden olduğunu doğrulamıştır.
Disclosures
Hayvan Bakım Kanada Konseyi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.
Acknowledgments
Yazarlar, Toronto, Ontario bölgesindeki Mount Sinai Hastanesi Dr. Rizaldy Scott birincil Rac1 Flox / Flox fare embriyonik fibroblastlar onun hediye için teşekkür etmek istiyorum . Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR, 2.009-93.526 MOP) ve Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC 327.372-06 RG) Enstitüleri NJ hibe işletim tarafından desteklenmiştir. SH ve MW CGSMA ve sırasıyla CIHR ve NSERC, KKS-M ödül tarafından desteklenmektedir.
Steve Hawley ve Melanie Wills bu kağıt için aynı derecede katkıda bulunmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad-CMV-Cre virus | Vector Biolabs | 1045 | |
| DME High glucose media 500mL | Fisher Scientific | SH3002201 | |
| FBS Canadian origin 500mL | VWR international | CAA15-701 | |
| PEN-STREP 1X solution 100mL | Fisher Scientific | SV30010 | |
| Texas Red-X phalloidin | Invitrogen | T7471 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4549 |
References
- Guo, F., Debidda, M., Yang, L., Williams, D. A., Zheng, Y. Genetic Deletion of Rac1 GTPase Reveals Its Critical Role in Actin Stress Fiber Formation and Focal Adhesion Complex Assembly. J. Biol. Chem. 281, 18652-18659 (2006).
- Glogauer, M., Marchal, C. C., Zhu, F., Worku, A., Clausen, B. E., Foerster, I., Marks, P., GP, D. owney, Dinauer, M., Kwiatkowski, D. J. Rac1 deletion in mouse neutrophils has selective effects on neutrophil functions. J. Immunol. 170, 5652-5657 (2003).
- Prost, S., Sheahan, S., Rannie, D., Harrison, D. J. Adenovirus-mediated Cre deletion of floxed sequences in primary mouse cells is an efficient alternative for studies of gene deletion. Nucleic Acids Res. 29, E80-E80 (2001).
- Rijnkels, M., Rosen, J. M. Adenovirus-Cre-mediated recombination in mammary epithelial early progenitor cells. J. Cell. Sci. 114, 3147-3153 (2001).
- Vidali, L., Chen, F., Cicchetti, G., Ohta, Y., Kwiatkowski, D. J. Rac1-null mouse embryonic fibroblasts are motile and respond to platelet-derived growth factor. Mol. Biol. Cell. 17, 2377-2390 (2006).
- Wang, H., Xie, H., Zhang, H., Das, S. K., Dey, S. K. Conditional gene recombination by adenovirus-driven Cre in the mouse uterus. Genesis. 44, 51-56 (2006).
