Summary
Wij bieden een gedetailleerd protocol voor het bereiden van primaire cellen los van
Abstract
Hier beschrijven we een methode voor het bereiden en het kweken van primaire cellen los te zien van Drosophila gastrula embryo's. Kortom, een grote hoeveelheid geënsceneerde embryo's van jonge en gezonde vliegen zijn verzameld, gesteriliseerd en vervolgens fysiek gescheiden in een enkele celsuspensie met een glazen homogenisator. Na te zijn uitgeplaat op kweekplaten of kamer dia's op een passende dichtheid in een kweekmedium, kunnen deze cellen verder te differentiëren in verschillende morfologisch-verschillende soorten cellen, die kunnen worden geïdentificeerd door hun specifieke cel-markers. Daarnaast presenteren we de voorwaarden voor de behandeling van deze cellen met dubbelstrengs (ds) RNA's tot gen knockdown te lokken. Efficiënte RNAi in Drosophila primaire cellen wordt bereikt door simpelweg het wassen van de cellen in dsRNA-bevattende kweekmedium. De mogelijkheid om uitvoering van een doeltreffend RNAi verstoringen, samen met andere moleculaire, biochemische, cell imaging analyses, zal een groot aantal vragen worden beantwoord in Drosophila primaire cellen, in het bijzonder die met betrekking tot gedifferentieerde spier-en neuronale cellen.
Protocol
1. Voorbereiding van de fly kooien
- Grow Drosophila (wild-type stammen, zoals Oregon-R of een genotype) in handige verpakkingen zoals een 32-oz insect cups.
- Overdracht nieuw eclosed vliegt naar grote embryo-collectie kooien of vliegen de bevolking kooien.
- Verplaats de kooien in een kamer met een temperatuur van ~ 25 ° C en de luchtvochtigheid ~ 65% in een lichte 12-h en een donkere 12-h-cyclus met het verzamelen van synchrone embryo's te vergemakkelijken.
- Houden de vliegen in de kooien door ze gedood gist plakken strepen op melasse platen. Wijzig de melasse platen (met gist gedood pasta) eenmaal per dag voor 2-3 d.
2. Verzameling van synchrone embryo's
- Op de dag van de primaire-celpreparaat, voeden de vliegen WTH verse platen gecoat met gedood gist pasta voor een 1-2 uur pre-lay periode.
- Net voor de 12-h donker cyclus, vervang dan de pre lagen borden met verse melasse platen strepen met een minimale hoeveelheid gist pasta. Gooi de pre lag collectie, die asynchroon oudere embryo's bevat.
- Verzamelen van embryo's voor een periode van 1-2 uur
- Verwijder de platen met de relatief synchrone bevolking van embryo's en bewaren bij 25 ° C gedurende 5-6 uur Embryo's zal op de geavanceerde gastrulastadium op dit moment.
3. Inzameling en het wassen van embryo's
- Draai de embryo's van de platen met een natte kwast, en spoel grondig af met lauw leidingwater door middel van een gestapelde reeks van zeven, zodat de embryo's in de fijnste zeef halen aan de onderkant. Spoel een paar minuten te verwijderen zoveel gist en vliegen puin mogelijk te maken.
- Tip van de zeven, zodat de embryo's zich ophopen aan de ene kant, en zacht was ze af van de zeef in een dechorionation mand.
- Ga naar de weefselkweek kap ruimte zonder dat de embryo's uitdrogen.
4. Homogenisatie van embryo's en plating van cellen
- Steriliseren en dechorionate de embryo's door ze onder te dompelen in 50% (vol / vol) bleekmiddel voor 5-10 minuten. Spoel de embryo's van de muur van het mandje met 70% (vol / vol) ethanol. Als alternatief, was het bleekmiddel uit embryo's met gedistilleerd water voordat ethanol behandeling. Vanaf dit punt embryo's moet worden behandeld in steriele omstandigheden en in de weefselkweek kap.
- Spoel de embryo's om het bleekmiddel en / of ethanol verwijderen met geautoclaveerd gedestilleerd water.
- Tijdens de dechorionation stap, vul een Dounce homogenisator met de juiste hoeveelheid van de kamertemperatuur M3 medium gebaseerd op de hoeveelheid van embryo's. De verhouding tussen het volume van de embryo's en die van de media mogen niet meer dan 0,5 ml embryo's: 40 ml media (of ~ 100-200 embryo / ml).
- Plaats de gespoeld embryo's in een gesteriliseerd beker met het bedrag van de M3 media genoeg is om onder water de embryo's. Laat de embryo's laten weken gedurende 2-5 minuten.
- Demonteer de dechorionation mand en dep de Nitex mesh droog met keukenpapier gesteriliseerd.
- Breng de embryo's in de homogenisator met een gesteriliseerde penseel.
- Homogeniseren voorzichtig met korte slagen met behulp van een losse stamper zonder het bereiken van de bodem van de buis totdat alle embryo's opgeschort. Dan voorzichtig, maar stevig, gehomogeniseerd met acht volle slagen. Draai niet aan de stamper als het beweegt op en neer.
- Breng de homogenaat in een steriele 50 ml conische centrifugebuis hetzij door gieten of pipetteren, en de dop op de tube.
- Centrifugeer gedurende 10 min bij 40g, kamertemperatuur pellet het weefsel puin, grote cel klonten en vitelline membranen. Breng de bovenstaande met de cellen en dooier met een schone buis en herhaal de centrifugatie stap voor 5 minuten.
- Breng voorzichtig de supernatant door gieten of pipetteren in een schone buis en spin voor 10 min bij 360 g, kamertemperatuur pellet de cellen. Giet het supernatans af. Resuspendeer de cel pellet in 10 ml kweekmedium (serum-vrij medium voor RNAi experimenten).
- Count levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer naar de cel dichtheid te schatten. Ondertussen, herhaalt u stap 4.10 tot pellet de cellen.
- Resuspendeer de cellen om een gewenste concentratie. Om te beginnen, probeer dan een bereik van 1 ~ 5 x 10 6 cellen / ml en uit op 1,7 tot 2,5 x10 5 cellen / cm 2 plaat.
5. Primaire cel RNAi voor cellen gekweekt op een 384-wells plaat
- Doseer 5 ul van dsRNA's in elk putje bij een uiteindelijke concentratie van ~ 250 ng per putje in een 384-wells plaat.
- Gebruik een multi-channel pipet, afzien van 10 ml (1 ~ 4x106 cellen / ml) van primaire cellen per putje in een serum-vrij M3 medium in een 384-wells plaat met een andere dsRNA in elk putje. Als alternatief kunnen cellen worden gekweekt op een 8-goed glas kamer dia's voor confocale beeldvorming.
- Centrifugeer de platen voor een min bij 300 g, kamertemperatuur. Cultuur van de cellen in serum-vrij medium bij 25 ° C voor 22 uur of bij 18 ° C gedurende 1-2 d.
- Voeg 30 ml serum-bevattende kweekmedium aan elke well. Centrifugeer de platen voor een min bij 300 g, kamertemperatuur.
- Leg de platen in een vochtige kamer en de cultuur van de primaire cellen voor een extra 5 ~ 7 d bij 25 ° C.
- Het imago van de cellen levend of na immunofluorescentiekleuring.
6. Representatieve resultaten:
In optimale omstandigheden, zal cellen in de cultuur van een gezonde look met een ronde morfologie. De cultuur zal weinig celresten, en worden 50 ~ 80% confluent na de eerste plating. Deze cellen zullen ondergaan morfologische veranderingen na gekweekt voor een langere periode van tijd. Het duurt meestal ongeveer 5-8 dagen voor cellen in de cultuur om ten volle worden onderscheiden bij 25 ° C. Goede kwaliteit primaire culturen worden doorgaans beoordeeld door hoe goed de cellen-of-interest worden onderscheiden in cultuur. Bijvoorbeeld, primaire spiercellen hebben vaak een tak-achtige morfologie en word meerkernige myotubes met streep-achtige myofibrillen bestaat uit een reeks van sarcomeren. Volledig gedifferentieerde myotubes zal meestal spontaan bewegen in de cultuur. In tegenstelling, gedifferentieerde primaire neuronen vormen clusters met hun cellichamen, en verbinden met andere clusters met hun axon kabels.
Figuur 1. Primaire cellen ondergaan morfologische veranderingen na uitgeplaat in de cultuur
(A) Een helder vlak beeld van primaire cellen direct na zijn uitgeplaat in een putje van een 384-wells plaat. De meerderheid van de cellen zijn rond en intact en goed gescheiden. (B) Een helder vlak beeld van de primaire celkweek 20 uur na plating. Primaire cellen zijn al opgenomen in clusters (grote pijlpunt) en de spieren met een tak-achtige morfologie (lange pijl) is te herkennen in dit stadium. (C) Een fase-contrast beeld van de primaire cultuur 5 dagen na de plating. De cultuur lijkt veel meer geavanceerd, met een neuronale extensies (kleine pijlen), neuronale clusters (grote pijlpunten) en spieren (middelgrote pijl).
Figuur 2. Voorbeelden van primaire cellen behandeld met dsRNA's gekweekt in een 384-wells plaat
Primaire cellen werden geïsoleerd uit de embryo's met Dmef2-Gal4, D42-Gal4, UAS-mito-GFP transgenen, waarin Dmef2-Gal4 en D42-Gal4 rijden expressie van mito-GFP in de spieren en motorische neuronen, respectievelijk. De cellen werden behandeld met dsRNA's gericht op zowel lacZ (AC) of opgeblazen (indien) (DF). Zowel primaire spieren en neuronen kan worden gezien door GFP (A, C, D, F). De witte pijlen wijzen naar de neuronale extensies. Phalloidin kleuring van actine (pijlpunten) toont een tak-achtige spier structuur in de cultuur die werden behandeld met lacZ dsRNA's (B en C), maar round-up spier morfologie in de cultuur die behandeld worden met als dsRNA's (E en F). In de samengevoegde foto's (C, F), zijn spieren gekleurd geel, maar rood negatieve shows neuronen en hun extensies (witte pijlen).
Figuur 3. Confocale microscopie van de primaire spieren gekweekt op menselijke vitronectine gecoate afdekglas dia's
Primaire spieren waren immunofluorescently gekleurd met anti-Drosophila titine (KZ) (rood in de samen te voegen) en met phalloidin voor actine (groen in de samen te voegen). De bovenste panelen zijn de wild-type controle spier-en onderkant daarvan zijn de Sals (CG31374) RNAi spier met verkorte sarcomeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ontwikkeling patroon van primaire culturen van Drosophila-cellen kan sterk variëren, mogelijk als gevolg van de verschillende variabelen tijdens de primaire cel voorbereidingsproces. Allereerst vliegen gebruikt voor eieren leggen moet worden jonge (binnen een week oud) en gezond (vrij van virale of bacteriële infectie). Onbevruchte of geïnfecteerde embryo's moet worden vermeden, want ze zijn nutteloos en cellen afkomstig van die embryo's niet kan onderscheiden en zal alleen overleven voor 1-2 dagen. Ten tweede, tijdens het homogeniseren proces, is het belangrijk niet te overbelasten de homogenisator met te veel embryo's. Overbelasting van het homogenisator met te veel embryo's zal leiden tot een toename van de hoeveelheid van puin en het aantal dode cellen, die uiteindelijk een compromis celdifferentiatie. Ten slotte moet cellen worden uitgeplaat op een passend dichtheid om goede differentiatie van primaire cellen te verzekeren. We vonden dat de differentiatie van zowel de neuronen en spiercellen drastisch wordt verminderd wanneer primaire cellen worden in eerste instantie uitgezet met een te hoge dichtheid.
Voor de fenotypische analyse worden 384-wells platen meestal gebruikt om primaire cellen voor screening of beeldvorming analyse op een lagere vergroting groeien. Beelden met een veel hogere vergroting en betere resolutie kan worden bereikt door de groeiende cellen op een cover-glazen kamer glijbaan, gevolgd door imaging live of gekleurde cellen met behulp van een confocale microscoop. Aangezien de meeste primaire cellen zijn aanhanger, moet het gebied voor het kweken van cellen in de put van kamer slides gebruikt worden als leidraad voor het inschatten van zowel het aantal cellen en de hoeveelheid medium die nodig is voor elk putje. Daarnaast, cover-glazen kamer dia's kunnen worden gecoat met extracellulaire matrix (ECM) eiwitten zoals menselijke vitronectine, aan laminine of collageen IV laten differentiatie van cellen-of-interest. Bijvoorbeeld, de primaire spieren slecht te onderscheiden op de niet-gecoate cover-glas, maar ook op de ECM-gecoate cover-glas. Tenslotte moet met het oog op autofluorescentie uitgezonden door kweekmedium, de reguliere kweekmedium, zoals Shield en Sang M3, te verminderen worden vervangen door een fly fysiologische zoutoplossing buffer, zoals HL6, vlak voor beeldvorming.
In principe kan dit protocol worden gebruikt voor de bereiding van primaire cellen van vliegen met een genotypes, zoals van homozygote levensvatbare en vruchtbare mutant voorraden, en van degenen die als embryo kan handmatig worden geselecteerd of door een sorter op basis van expressie van GFP, of te uiten weefsel-specifieke Gal4, UAS-gen X genotypes. In combinatie met andere methoden experimenteren, zal dit protocol kan een groot aantal vragen die moeten worden aangepakt, met name die welke betrekking hebben op gedifferentieerde cellen, zoals neuronen en spieren, en zijn moeilijk aan te pakken in gekweekte cellijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
JB werd gesteund door de Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship DRG-1716-1702. JZ werd ondersteund door NIH / NIGMS Fellowship F32 GM082174-02. NP is een onderzoeker van de Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| #25 US standard testing sieve | VWR international | 57334-454 | |
| #45 US standard testing sieve | VWR international | 57334-462 | |
| #120 US standard testing sieve | VWR international | 57334-474 | |
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Costar, 384-well plate | VWR international | 29444-078 | |
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
- Bai, J. RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance . Development. 135, 1439-1449 (2008).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Donady, J. J., Fyrberg, E. Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro. TCA Manual. 3, 685-687 (1977).
- Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae. Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).
- Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening. Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).
