Summary
इस प्रोटोकॉल रहने वाले कृंतक मस्तिष्क के एक निश्चित क्षेत्र के लिए आनुवंशिक constructs के प्रसव के एक गैर वायरल विधि का वर्णन करता है. विधि प्लाज्मिड तैयारी, micropipette निर्माण, नवजात चूहे पिल्ला सर्जरी, निर्माण के microinjection, और के होते हैं
Abstract
ट्रांसजेनिक जानवरों के निर्माण vivo में ब्याज की एक जीन के कार्यों का अध्ययन करने में एक मानक दृष्टिकोण है. हालांकि, कई पीटकर या ट्रांसजेनिक जानवर उन मामलों में जहां संशोधित जीन व्यक्त की है या पूरे जीव में नष्ट कर दिया व्यवहार्य नहीं हैं. इसके अलावा, प्रतिकरात्मक तंत्र के एक किस्म अक्सर यह मुश्किल परिणामों की व्याख्या करने के लिए. प्रतिपूरक प्रभाव या तो समय जीन अभिव्यक्ति या ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की मात्रा सीमित द्वारा alleviated किया जा सकता है.
प्रसव के बाद गैर - निलय microinjection के विधि और vivo electroporation में जीन, siRNA या डाई अणु सीधे नवजात कृंतक मस्तिष्क में ब्याज की एक छोटे से क्षेत्र के लक्षित वितरण की अनुमति देता है. पारंपरिक निलय इंजेक्शन तकनीक के विपरीत, इस पद्धति गैर प्रवासी सेल प्रकार का अभिकर्मक की अनुमति देता है. विधि यहाँ वर्णित के माध्यम से ट्रांसफ़ेक्ट पशु दो photon के लिए उदाहरण के लिए, vivo इमेजिंग में या तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें पर electrophysiological प्रयोगों में इस्तेमाल किया.
Protocol
1. परिचय
ट्रांसजेनिक जानवर का निर्माण 1 जानवरों में रहने वाले और unraveling रोग तंत्र 2,3 के लिए के रूप में अच्छी तरह के रूप में 4 कोशिकाओं के गुणों को जोड़ तोड़ के लिए जीन के कार्यों की जांच की एक शक्तिशाली विधि है. हालांकि, प्रक्रिया श्रमसाध्य है बल्कि, बहुत समय लेने और महंगी है, इस प्रकार वायरल इंजेक्शन 5, 6 electroporation के साथ और utero electroporation 7,8 में नवजात निलय इंजेक्शन के रूप में वैकल्पिक जीन डिलीवरी के तरीकों का उपयोग warranting. संभावना हित के क्षेत्र में एक स्थानीय अभिव्यक्ति पैटर्न बनाने; गैर प्रवासी सेल प्रकार के स्वस्थानी अभिकर्मक में cortical जैसे गैर वायरल आनुवंशिक constructs का उपयोग: प्रसव के बाद गैर - निलय इंजेक्शन और electroporation की विधि लाभ का एक अनूठा सेट है astrocytes.
इस वीडियो में, हम नवजात चूहे बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए चिकन के साथ सीएमवी (pCAG EGFP) बढ़ाने 9 बीटा actin के प्रमोटर के तहत एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग का उपयोग कर मस्तिष्क को प्रसव के बाद जीन डिलीवरी की विस्तृत प्रक्रिया प्रदर्शित करता है. हम प्लाज्मिड युक्त इंजेक्शन समाधान की तैयारी के वर्णन, पतली गिलास pipettes के विनिर्माण और एक stereotactic साधन पर microinjector के कोडांतरण. फिर हम isoflurane के साथ चूहे पिल्ले anaesthetizing के बारे में बात करते हैं, सर्जरी प्रदर्शन के बारे में इंजेक्शन की प्रक्रिया के बारे में और संदंश इलेक्ट्रोड और vivo porator में का उपयोग electroporation के बारे में. अंत में, हम संक्षेप में प्रत्याशित परिणाम दृष्टिकोण, और कठिनाइयों है कि इन प्रयोगों के दौरान उत्पन्न हो सकती है चर्चा.
2. Electroporation के लिए प्लाज्मिड तैयारी
- हम आम तौर पर एक 200 μl पतली दीवार ट्यूब में प्लाज्मिड इंजेक्शन समाधान के 10 μl तैयार. यह समाधान कई प्रयोगों के लिए पर्याप्त है.
- हम 10X पीबीएस के 1 μl (सामग्री और उपकरणों को देखें) और 0,1% फास्ट ग्रीन पानी के घोल (सामग्री और उपकरणों को देखें) का 1 μl के साथ मिश्रण प्लाज्मिड समाधान के 8 μl (सामग्री और उपकरणों को देखें).
- इंजेक्शन समाधान में प्लाज्मिड के अंतिम एकाग्रता के बीच 1 और 3 / μg μl होना चाहिए. प्लास्मिड डीएनए के कम सांद्रता अभिकर्मक दक्षता को कम करने, जबकि उच्च डीएनए एकाग्रता इंजेक्शन के लिए भी चिपचिपा केशिका गिलास पतली टिप के माध्यम से किया जाएगा.
3. ग्लास सुई तैयार
- ग्लास विंदुक तैयारी के लिए, हम अधिकतम खींच रहा है और हीटिंग मापदंडों पर borosilicate एक रेशा के साथ केशिका गिलास (सामग्री और उपकरणों को देखें) और एक ऊर्ध्वाधर इलेक्ट्रोड कांच खींचने (सामग्री और उपकरणों को देखें) का उपयोग करें.
- हम तो कागज का एक टुकड़ा का उपयोग करने के लिए कोई टिप व्यास में 10-20 सुक्ष्ममापी हासिल पिपेट की नोक तोड़.
- हम टिप और माइक्रोस्कोप उद्देश्य के तहत व्यास के आकार की जाँच करें.
4. Microinjector कोडांतरण
- एक पतली केशिका बहुलक (सामग्री और उपकरणों को देखें) हम एक 10 μl हैमिल्टन सिरिंज की मात्रा के लगभग 1 / 3 भरने (सामग्री और उपकरणों को देखें) खनिज तेल के साथ (सामग्री और उपकरणों को देखें) का प्रयोग. हवाई बुलबुले से बचें!
- तो फिर हम खनिज तेल के साथ कांच विंदुक को भरने और हैमिल्टन सिरिंज में पिपेट सम्मिलित है. हवाई बुलबुले से बचें!
- कांच विंदुक के साथ सिरिंज तो एक नियंत्रक से जुड़ा microinjector पर तय हो गई है (सामग्री और उपकरणों को देखें).
- microinjection एक stereotactic साधन (सामग्री और उपकरणों को देखें) पर तय सेटअप हमें सुरक्षित ट्यूब प्लाज्मिड इंजेक्शन समाधान के साथ ग्लास विंदुक टिप को विसर्जित करने के लिए अनुमति देता है.
- जब टिप समाधान की सतह को छू लेती है, यह 1 से आगे या 2 मिमी डुबकी और इंजेक्शन सूक्ष्म सुई लगानेवाला नियंत्रक का उपयोग कर मिश्रण के लगभग 1 μl के साथ विंदुक भरने.
5. Anaesthetizing जानवर
सभी यहाँ प्रस्तुत प्रक्रियाओं पशु प्रयोगों के लिए विश्वविद्यालय के हेलसिंकी नियमों के अनुसार प्रदर्शन किया गया.
- प्रत्येक प्रयोग के लिए, हम isoflurane के लगभग 2 मिलीलीटर के साथ एक सिरिंज गैस तंग (सामग्री और उपकरणों को देखें) को भरने के (सामग्री और उपकरणों को देखें).
- दैन सिरिंज संज्ञाहरण इकाई (सामग्री और उपकरणों को देखें) वायु प्रवाह के स्रोत से जुड़ा पर तय हो गई है, पशु बॉक्स और मुखौटा stereotactic स्थापना पर तय है.
- संज्ञाहरण इकाई पर, हम लगभग मिलीग्राम / मिनट और isoflurane स्तर 4% करने के लिए 250 airflow समायोजित.
- हम 2-5 मिनट के लिए पशु बॉक्स में पिल्ला चूहे जगह है.
- जब पिल्ला बंद हो जाता है हिल, हीटिंग पैड (सामग्री और उपकरण देखें) stereotactic सेटअप करने के लिए संलग्न पर जगह है.
- Anaesthetizing मुखौटा में है पिल्ला सिर के एक व्याख्यान चबूतरे वाला भाग रखें.
- के लिए 5 से 10 मिनट लगते हैंगहरी संज्ञाहरण दर्ज पिल्ला.
- एक पूंछ चुटकी के साथ संज्ञाहरण गहराई की जाँच करें और के बारे में 1.5 से 2.0% करने के लिए isoflurane आमद में कमी.
6. सर्जरी Microinjection, और electroporation
- 70% इथेनॉल के साथ पिल्ला सिर पर त्वचा समझो.
- छोटे (सामग्री और उपकरणों को देखें) कैंची और पतली संदंश का प्रयोग (सामग्री और उपकरणों को देखें), अपने माथे के लिए पिल्ला की एक कूड़ा से त्वचा में कटौती.
- त्वचा टुकड़े बग़ल बेंड और सिर और त्वचा के निर्धारण के लिए खोपड़ी के कर्ण orifices में थोड़ा कान सलाखों खींच.
- एक द्विनेत्री माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, हम खोपड़ी पर bregma बिंदु का पता लगाने.
- Stereotactic निर्देशांक का उपयोग हित के क्षेत्र को पहचानें.
- इस क्षेत्र के ऊपर इंजेक्शन विंदुक स्थिति और यह खोपड़ी की सतह पर इंजेक्शन समाधान के 25-50 nl छोड़ने के द्वारा चिह्नित.
- खोपड़ी धीरे और ध्यान से चिह्नित खुर्दबीन के नीचे एक उच्च गति शल्य चिकित्सा ड्रिल (सामग्री और उपकरण देखने) का उपयोग बिंदु पर जब तक तरल drilled क्षेत्र में प्रकट होता है है ड्रिल.
- वर्तमान प्रवाहकीय जेल के साथ खोपड़ी के पक्षों पर एक electropotation संदंश (सामग्री और उपकरणों को देखें) इलेक्ट्रोड (सामग्री और उपकरणों को देखें) तय करने के लिए बेहतर चालकता प्राप्त करने के लिए.
- निकालें तरल drilled छोटे तंपन का उपयोग छेद से ड्रॉप (सामग्री और उपकरणों को देखें) और छेद करने के लिए इंजेक्शन साइट के निर्देशांक के अनुसार कांच सुई डुबकी.
- 5 से 20 nl / सेक की दर में इंजेक्शन के समाधान के 25 से 100 nl दिखे.
- जल्दी विंदुक को हटा दें और तुरंत electroporate. Electroporation एमएस 50 और 1 हर्ट्ज की आवृत्ति में 99 वी के आयाम की अवधि के साथ पांच आयत दालों को लागू करने के द्वारा किया जाता है.
- इलेक्ट्रोड और कान सलाखों निकालें.
- कटौती एक गूंगा (सामग्री और उपकरणों को देखें) और तेज संदंश और शल्य चिकित्सा धागे (सामग्री और उपकरणों को देखें) का एक संयोजन का उपयोग कर त्वचा सीना.
- 15-30 के लिए संज्ञाहरण के बाद अपने वसूली सहायता मिनट के लिए गर्म चेंबर में पिल्ला प्लेस.
- फिर पिल्ला वापस अपनी माँ के पिंजरे डाल दिया.
7. प्रतिनिधि परिणाम
सफलतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में transgene की अभिव्यक्ति electroporation के बाद लगभग 10 घंटे प्रकट होगा, और यह कई हफ्तों के लिए स्थिर रहेगा.
हम या तो गहरी cortical परतों या प्रसव के बाद दो दिन (P2) Wistar चूहे पिल्ले के striatum क्षेत्र में प्लाज्मिड और microinjected vivo electroporation में प्रदर्शन के रूप में ऊपर वर्णित है. मस्तिष्क स्लाइसें (मोटाई में 400 सुक्ष्ममापी) 2 से 6 दिन के बाद काट रहे थे (P4-P8) ठंड टुकड़ा करने की क्रिया के माध्यम से एक vibrotome का उपयोग (Hepes है Earle बैलेंस्ड नमक समाधान buffered) 10. छवि अधिग्रहण कमरे के तापमान पर टुकड़ा करने की क्रिया के माध्यम Zeiss Axioplan 2 LSM5 पास्कल confocal खुर्दबीन (Zeiss, जर्मनी) का उपयोग कर प्रदर्शन किया था.
गहरे cortical परतों और striatum में इंजेक्शन साइटों कई ट्रांसफ़ेक्ट EGFP है कि व्यास (चित्रा 1 ए, बी) में लगभग 200-300 सुक्ष्ममापी की एक कॉम्पैक्ट क्षेत्र में स्थित थे व्यक्त कोशिकाओं निहित. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के भीतर, EGFP अभिव्यक्ति पर्याप्त उच्च स्तर के लिए कांटा के साथ अलग आकृतियों (चित्रा 1D) और अक्षतंतु बंडलों (चित्रा 1E) की dendrites सहित पतली सेलुलर प्रक्रियाओं (चित्रा 1C) की इमेजिंग की अनुमति. के रूप में अच्छी तरह के रूप में electroporation के बाद सेल व्यवहार्यता EGFP मजबूत स्थिरता axons की cortical टर्मिनलों (चित्रा 1F) जैसे बाहर भागों (1.5-2 मिमी अप करने के लिए सेल शरीर से) अनुरेखण की अनुमति दी.
चित्रा 1 (ए) सफलतापूर्वक P4 चूहा मस्तिष्क के प्लाज्मिड इंजेक्शन साइट delineating striatum क्षेत्र में कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट. (बी) P5 चूहा मस्तिष्क के गहरे cortical परतों में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (cortical सतह के नीचे लगभग 1000 सुक्ष्ममापी). (सी) P8 चूहा मस्तिष्क के striatum क्षेत्र में एक ट्रांसफ़ेक्ट सेल. (डी) P8 चूहा मस्तिष्क के striatum क्षेत्र में ट्रांसफ़ेक्ट सेल के वृक्ष के समान प्रक्रियाओं, तीर के विभिन्न प्रकार के वृक्ष के समान spines और filopodia से संकेत मिलता है. (ई) संपार्श्विक मार्ग के भीतर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के axons. (एफ) axons P8 चूहा प्रांतस्था (arrowhead) के pial सतह पर समाप्त. स्केल सलाखों के ए, बी, ई, एफ और 100 सुक्ष्ममापी हैं, सी और डी पर 10 सुक्ष्ममापी
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Discussion
Utero electroporation 7,8,11,12 में रहने वाले कृंतक मस्तिष्क में जीन वितरण के तरीके को अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं, और अधिक हाल ही में प्रसव के बाद 6 electroporation के लिए. हालांकि, इन तरीकों डीएनए प्लाज्मिड, जो कई अनुप्रयोगों के लिए सीमित किया जा सकता है की intraventricular इंजेक्शन पर आधारित हैं. उदाहरण के लिए, इन तरीकों हिप्पोकैम्पस है, और न ही ऐसे गैर प्रवासी cortical astrocytes के रूप में सेल प्रकार का अभिकर्मक के रूप में कुछ मस्तिष्क क्षेत्रों में कोशिकाओं को लक्षित की अनुमति नहीं देते. Electroporation के साथ मिलकर गैर - निलय इंजेक्शन पहले अनुमस्तिष्क 13 न्यूरॉन्स में जीन डिलीवरी के लिए इस्तेमाल किया गया था . हमारी प्रोटोकॉल चूहा मस्तिष्क के अन्य क्षेत्रों के लिए गैर - निलय विधि का विस्तार दिखाता है. हम प्रस्ताव है कि हमारे methodological दृष्टिकोण प्रसवोत्तर चूहे मस्तिष्क के भीतर 5 जीन प्रतिबंधित क्षेत्रों के लिए ब्याज की डिलीवरी की वायरल तरीकों के लिए एक उपयोगी विकल्प है .
वर्तमान विधि के लाभ के बावजूद, कुछ कठिनाइयों की उम्मीद के रूप में नीचे चर्चा कर सकते हैं.
जानवर की 1.Optimal उम्र
जब संभव हो, छोटे नवजात चूहे पिल्ले का उपयोग एक साधन के रूप में सर्जरी के बाद दोनों अभिकर्मक प्रभावकारिता बढ़ाने के लिए और पिल्ला अस्तित्व, होना चाहिए. हमारे हाथों में, P0 पिल्ले बहुत छोटे हैं के रूप में यह मुश्किल है reproducibly निर्देशांक stereotactic इस 14 वर्ष की आयु के लिए मस्तिष्क उपलब्ध एटलस से प्राप्त का उपयोग कर मस्तिष्क में एक निश्चित क्षेत्र लक्ष्य. इसके अलावा, P0 पिल्ले कि सिलाई बाधित हो सकता है पतली और निविदा त्वचा है. पी 3 और पी 4 शल्य चिकित्सा और stereotactic जोड़तोड़ के मामले में सबसे सुविधाजनक के रूप में P0-P2 पशुओं की तुलना में कर रहे हैं, लेकिन वे isoflurane संज्ञाहरण है कि सर्जरी के दौरान बरामदगी और साँस लेने में रुकावट पैदा हो सकता है करने के लिए hypersensitivity है. इस प्रकार, सबसे अच्छा विकल्प P1-P2 चूहे पिल्ले जो उम्मीद के मुताबिक सर्जरी के दौरान और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य microinjections के लिए काफी बड़े हैं.
Microinjection के साथ 2.Possible समस्याओं
जब समाधान (25-100 nl) के छोटे मात्रा पतली गिलास टिप के माध्यम से मस्तिष्क के ऊतकों को इंजेक्ट कर रहे हैं डालती एक विरोध दबाव है, यह महत्वपूर्ण है कि हवा बुलबुले या चोरी ध्यान से परहेज कर रहे हैं. इन से बचने में विफलता अभिकर्मक दक्षता में एक नाटकीय कमी का कारण हो सकता है.
Stereotactic निर्देशांक के लिए 3.Precision सीमा
Stereotactic निर्देशांक की परिशुद्धता के बावजूद, वे 0.3 मिमी 15 reproducibility पर एक सीमा होती है . हमारे अनुभव का उपयोग एक ही उम्र और वजन के पशुओं में यह संभव है 0.2-0.1 मिमी है जो CA1 hippocampal क्षेत्र की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य लक्ष्यीकरण के लिए पर्याप्त है करने के लिए इस सीमा में कमी.
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Acknowledgments
हम वीडियो के लिए ध्वनि रिकॉर्डिंग, इवान Molotkov सीएजी EGFP प्लाज्मिड तैयारी के लिए 3 डी एनीमेशन और डॉ. पीटर Blaesse के लिए के साथ मदद के लिए एकातेरिना Karelina धन्यवाद.
काम फिनलैंड के अंतर्राष्ट्रीय गतिशीलता, फिनिश सांस्कृतिक फाउंडेशन और फिनलैंड के अकादमी के केंद्र से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | equipment | XYtronic | XY-2A-SA | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | equipment | Supertech | TMP-5b | |
| Borosilicate tube with filament | material | Sutter Instrument Co. | BF120-69-10 | Glass needle |
| Disposable drills | material | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | reagent | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | equipment | Fine Science Tools | 91150-20 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Ealing micr–lectrode puller | equipment | Ealing | 50-2013 | Vertical electrode glass puller |
| Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c | material | Johnson & Johnson | EH7177H | Surgical threads |
| Exmire micro syringe 10.0 ml | equipment | Exmire | MS*GLLX00 | Gas-tight syringe |
| Fast Green | reagent | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Forceps electrodes | equipment | BEX | LF650P3 | Treat with 70% ethanol for disinfection prior to use |
| Foredom drill control | equipment | Foredom | FM3545 | Surgical drill power supply and control. Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Foredom micro motor handpiece | equipment | Foredom | MH-145 | Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Gas anesthesia platform for mice | equipment | Stoelting Co. | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Isoflurane | reagent | Baxter Internationl Inc. | FDG9623 | |
| Micro dressing forceps, 105 mm | equipment | Aesculap | BD302R | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Microfil | material | World Precision Instruments, Inc. | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | reagent | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | equipment | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | Hamilton syringe |
| plasmid CAG-EGFP | reagent | Extracted and purified with EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and dissolved in nuclease free water to concentration 1.5 mg/ml | ||
| Pulse generator CUY21Vivo-SQ | equipment | BEX | CUY21Vivo-SQ | |
| Schiller electrode gel | reagent | Schiller AG | 2.158000 | Conductive gel |
| Small animal stereotaxic instrument | equipment | David Kopf Instruments | 900 | |
| St–lting mouse and neonatal rat adaptor | equipment | Stoelting Co. | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument.Treat earbars with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | equipment | Fine Science Tools | 91460-11 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Sugi absorbent swabs 17 x 8 mm | material | Kettenbach | 31602 | Surgical tampons |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | equipment | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Univentor 400 Anesthesia Unit | equipment | Univentor | 8323001 |
References
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