Summary
يطبع ظاهرة التكاثر في النباتات والثدييات. الحامض النووي يلعب دورا مهما في آليات يطبع. عزل وتحديد مركز السويداء مثيلة من الجينات في مطبوع
Abstract
thaliana Arabidopsis هو كائن نموذجا ممتازا لدراسة آليات جينية. أحد الأسباب هو متحولة خالية من خسارة وظيفة من methyltransferases الحمض النووي قابلة للحياة ، وبالتالي توفير نظام لدراسة كيفية فقدان الحامض النووي في الجينوم يؤثر على النمو والتنمية. يطبع التعبير يشير إلى الفرق الأليلات الأم والأب ، ويلعب دورا هاما في عملية التنمية في كل من استنساخ الثدييات والنباتات. الحامض النووي هو أمر حاسم لتحديد ما إذا كان يتم التعبير عن الأب أو الأم الأليلات لجينة مطبوع أو إسكاته. في النباتات المزهرة ، وهناك حدث الإخصاب مزدوجة في الاستنساخ : خلية واحدة يخصب الحيوان المنوي البويضة لتشكيل خلية الجنين والصمامات الحيوانات المنوية الثاني مع الخلية المركزية تثير السويداء. السويداء هو الأنسجة حيث يطبع يحدث في النباتات. MEDEA ، مجموعة مجموعة الجينات Polycomb المجال ، وFWA ، وهو عامل النسخ تنظيم المزهرة ، هم أول اثنين من الجينات أظهرت أن تكون مطبوعة في السويداء والتعبير عنها هي التي تسيطر عليها الحامض النووي ونزع الميثيل في النباتات. من أجل تحديد الوضع يطبع من الجينات ونمط مثيلة في السويداء ، ونحن بحاجة إلى أن تكون قادرة على عزل السويداء الأول. منذ البذور صغيرة في Arabidopsis ، فإنه لا يزال تحديا لعزل السويداء Arabidopsis ودراسة مثيلة لها. في هذا البروتوكول الفيديو ، فإننا تقرير كيفية إجراء عبر الجينية ، لعزل نسيج السويداء من البذور ، وتحديد حالة مثيلة بواسطة التسلسل بيسلفيت.
Protocol
أولا معبر الوراثية
1. يضعف الأصل الإناث
من أجل التمييز بين الأم والأب الأليلات باستخدام الحمض النووي تسلسل تعدد الأشكال ، وهما ecotypes مختلفة ، وسيتم اختيار مثل كولومبيا - 0 (العقيد - 0) ، ولير ، والآباء والأمهات من الإناث والذكور. وينبغي أن تكون النباتات من الشباب والأصحاء. يمكن للمرء أن تؤدي إلى إضعاف الوالد الإناث باستخدام مجهر تشريح ، اقي المكبرة ، أو بالعين المجردة. تحديد المرحلة الزهور - 12 (سميث وآخرون ، 1990) ، وإزالة أي الزهور أو siliques فوق وتحت لهم لقطة قاعدة ساق مع المقص. تعقيم بواسطة ملقط غمس قاعدة غيض برفق في كوب من الايثانول 95 ٪ ، مما سيزيل أي حبوب اللقاح على ملقط وقتل حبوب اللقاح كذلك. حدق بلطف بعيدا عن براعم الزهور باستخدام الملقط ، وإزالة بلطف 4 سيبالس ، بتلات 4 و 6 الأسدية ، وترك المدقة العارية وسليمة. في محاولة لتجنب الأضرار التي لحقت كربلات خلال هذه العملية.
2. اختيار الجهة المانحة حبوب اللقاح والاضطلاع التلقيح
وanthesed المانحين أفضل لقاح الزهور فتح في المرحلة 14 مع بتلات تمتد بزاوية 90 درجة إلى المدقة (سميث وآخرون ، 1990) ، وفيه الكثير من غبار الطلع ذرف. الاستيلاء على زهرة في القاعدة وعادل فوق ساق ، والذي يؤدي إلى انتشار الزهرة مفتوحة. الغبار وصمة العار التي أعدت من المدقة مع العضو الذكري. بعد التلقيح ، ستتم تغطية وصمة العار مع حبوب اللقاح أصفر ، والتي يمكن ملاحظتها بسهولة تحت المجهر.
3. وسم الصليب
بعد تلقيح جميع المدقات عاجزة عن محطة ، ونحن مع التسمية الصليب علامة المجوهرات والمعلومات من الآباء الذكور والإناث والتاريخ. مكان حصة في التربة بالقرب من المصنع ، استخدام سلسلة لادراك التعادل ، تنبع من الإزهار للخطر ، وتغطية التلقيح المدقات بكيس من البلاستيك.
II. عزلة مناديل السويداء في Arabidopsis
1. إعداد المواد
عادة ما نحصل على المواد اللازمة جاهزة قبل الحصاد والسويداء وأنسجة الجنين : خزان النتروجين السائل والنيتروجين السائل ، ومجهر تشريح ، واثنين من أزواج جديدة من غرامة غيض ملقط (5 INOX بواسطة FST البيولوجيا دومون ، سويسرا) ، الشرائح الزجاجية المجهر ( 3 "X 1" X 1.0 ملم) ، ودرجة الحموضة 5.7 0.3 حل M السوربيتول وزارة التربية والعلم 5 ملم.
2. جمع siliques
في 7 -- 8 أو يوما بعد التلقيح (DAP) ، والبذور جاهزة للحصاد في منتصف إلى مرحلة متأخرة من التطور الجنيني نسف والسويداء وتشريح للجنين. في بعض الأحيان ، قد يستغرق 9-10 DAP إذا الزهور عاجزة صغار جدا.
3. عزل السويداء والجنين
منذ بذور Arabidopsis ضئيلة ، ونحن استخدام مجهر تشريح لعزل السويداء والجنين. وضع silique 8 - DAP تحت المجهر ، واستخدام زوج من ملقط لعقد عنيقة silique واستخدام غيض من زوج آخر من ملقط لفتح الشريحة silique في الهامش حيث اثنين كربلات الصمامات. استخدام زوج من ملقط لالتقاط بذرة واحدة على 5.7 درجة الحموضة حلول 0.3 M السوربيتول و 5 ملي زارة التربية والعلم ، وجعل قطع صغير في نهاية micropyle تنزلق إلى الجنين ، تضغط على نهاية غير المصقول على طرد السويداء والسويداء منفصلة عن معطف البذور (كينوشيتا وآخرون ، 2004). وضع الجنين والسويداء في microtubes منفصلة في النيتروجين السائل. علينا مواصلة هذا العمل حتى تتراكم الجنين أو السويداء 10-15 siliques وتخزينها ثم الأنبوب في الفريزر -80 درجة مئوية. في بعض الحالات ، السويداء لا بد من فصل من معطف البذور ، أي يمكن للمرء أن عزل الحمض النووي الريبي مجموع من السويداء والبذور مزيج معطف لتحليل البصمة الجينية.
III. تسلسل بيسلفيت
1. الكواشف المطلوبة
Cetyltrimethyl بروميد الأمونيوم (CTAB) لإعداد الحمض النووي الجيني ، والانزيمات التقييد ، 3 M هيدروكسيد الصوديوم (الطازجة) ، 6،42 م م الصوديوم اليوريا / 4 بيسلفيت (2 ميتابيسلفيت الصوديوم M ، سيغما الدريخ ، S9000 ، Na2S2O5 ، الوزن الجزيئي : 190) ، الهيدروكينون 10 مم ، طقم تنقية الحمض النووي (DNA Promega معالج تنظيف النظام ، القط. # A7280) ، TE العازلة ، 6.3 M هيدروكسيد الصوديوم (الطازجة) ، و 10 M NH 4 OAC ، 20 ميكروغرام / ميكرولتر الحمض الريبي النووي النقال ، والإيثانول بنسبة 100 ٪ .
2. تفاصيل بروتوكول العلاج بيسلفيت
- عزل الحمض النووي أو السويداء الجينومية الجنين باستخدام إجراء CTAB (روجرز وBendich ، 1988).
- 100 نانوغرام هضم -- 2 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني في 20 ميكرولتر إلى 100 الحجم الإجمالي ميكرولتر مع تقييد الانزيمات التي تقطع من خارج المنطقة لتحليلها. لالمروج MEA ، ونحن نستخدم XhoI ، NdeI وPstI أو HindIII.
- تفسد الانزيمات التقييد غليان الحمض النووي لمدة خمس دقائق ثم تطفئ على الجليد.
- إضافة 09/01 حجم (2.2 ميكرولتر الحمض النووي لاستيعاب 20 ميكرولتر) من هيدروكسيد الصوديوم واحتضان م 3 عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- الحل لنقل أنبوب 250 PCR ميكرولتر.
- حل 7.5 غرام من اليوريا في 10 مل من الماء المقطر المعقم ، ويضاف ببطء 7.6 غرام من الصوديوم ميتابيسلفيت خلال 1-2 ساعات وعادة ما يساعد على حل التدفئة ؛ ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5 الطازجة مع هيدروكسيد الصوديوم M 10 ؛ إضافة الماء المقطر المعقم إلى النهائي إلى حجم 20 مل. هذا هو 6،24 م اليوريا / 4 بيسلفيت الصوديوم حل M.
- إضافة اليوريا 6.24 م / 4 بيسلفيت الصوديوم M حل لتركيز النهائي من 5.36 م وM 3.44 ، على التوالي (بولين وآخرون ، 1998). على سبيل المثال ، إضافة 208 ميكرولتر من اليوريا 6.42 م / 4 بيسلفيت الصوديوم M حل لميكرولتر 22.2 أعلاه من الحمض النووي الجينومي متمسخ (شياو وآخرون ، 2003).
- إضافة الهيدروكينون 10 ملم الى الحمض النووي في التركيز النهائي من 0.5 مم (12 ميكرولتر الهضم لمدة 20 ميكرولتر).
- علاج السلوك بيسلفيت في جهاز PCR : 30 دورات من 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وثانية 95 درجة مئوية لمدة 30.
- Desalt بيسلفيت الحمض النووي DNA المعالجة باستخدام معالج تنظيف النظام من Promega ومتابعة البروتوكول (جاكوبسن وآخرون ، 2000).
- قياس حجم بالضبط TE تعافى من العمود بعد إزالة الملوحة وإضافة هيدروكسيد الصوديوم 6.3 M إلى التركيز النهائي لاحتضان 0.3 م في 37 دقيقة لمدة 15 درجة مئوية.
- إضافة 10 M NH 4 OAC (الرقم الهيدروجيني 7.0) إلى تركيز النهائي من 3 م ، 2 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / ميكرولتر الحمض الريبي النووي النقال ، و 3 مجلدات من الإيثانول بنسبة 100 ٪ ومن ثم المزيج. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 14000 دورة في الدقيقة.
- يغسل مرة واحدة مع بيليه الايثانول 70 ٪ ، لا جهاز للطرد المركزي قصيرة ، وإزالة الايثانول اضافية.
- بيليه الجافة في speedvac لمدة 5-10 دقائق وresuspend في 25-100 العازلة TE ميكرولتر اعتمادا على المبلغ ابتداء من الحمض النووي. بيسلفيت الصوديوم المعاملة الحمض النووي هو الآن على استعداد لتحليل PCR.
3. PCR التضخيم
- منذ يتم تحويلها إلى cytosines unmethylated اليوراسيل ، فإنه من الصعب تضخيم شظية كبيرة باستخدام الحمض النووي بيسلفيت المعاملة كقالب. وبالتالي ، فإننا عادة تصميم الاشعال لتضخيم منتج لم يعد من 500 سنة مضت. لتسلسل المروج MEA - 4 كيلوبايت ، قمنا بتصميم مجموعات كثيرة من أجهزة الاشعال وتضخيم 14 شظايا متداخلة لتغطية المنطقة بأسرها (شياو وآخرون ، 2003).
- لتسلسل الأعلى الجديلة ، في تصميم التمهيدي إلى الأمام ، وأنا) اختيار (G جوانين) المنطقة الغنية من أجل الحصول على أعلى درجة حرارة الصلب دون نكليوتيد اضافية في الاشعال ؛ الثاني) تغيير C (سيتوزين) إلى ص ( البيريميدين) في الفريق الاستشاري والسياقات CNG وتغيير C المتبقية T (الثايمين). في تصميم التمهيدي العكسي ، I) اختيار منطقة C - الغنية ؛ الثاني) لتغيير G R (البيورين) في سياقات CG والغاز الطبيعي المضغوط وتغيير G المتبقية A (الأدنين).
- لتسلسل أسفل الجديلة ، في تصميم التمهيدي إلى الأمام ، وأنا) اختيار منطقة C - الغنية ؛ الثاني) لتغيير G R CG في سياقات والغاز الطبيعي المضغوط وتغيير G المتبقية أ في تصميم التمهيدي العكسي ، I) اختر منطقة G - الغنية ؛ الثاني) C لتغيير Y (بيريميدين) في سياقات CG والغاز الطبيعي المضغوط وتغيير C المتبقية إلى T.
- نستخدم عادة 1-2 ميكرولتر من الحمض النووي لمعاملة بيسلفيت الصوديوم كقالب لكل PCR التضخيم (شياو وآخرون ، 2003). PCR المنتج يجب أن يكون عن طريق تحليل الكهربائي للهلام لتأكيد الحجم الصحيح للقطعة ، ثم لابد من تنقية جل والمستنسخة في TOPO TA pCR2.1 ناقلات الاستنساخ (Invitrogen) باعتبارها إدراج. يتم اختيار مستعمرة واحدة حتى والمثقف ؛ الحمض النووي المستخرج البلازميد وأرسلت للتسلسل.
4. تحليل تسلسل
مبدأ التسلسل بيسلفيت أنه سيتم تحويلها إلى السيتوزين unmethylated اليوراسيل بسبب نزع الأمين حلمهي بواسطة تركيزات عالية من الصوديوم في بيسلفيت pH5.0 التي سوف تتضخم والثايمين في الناتج PCR ، في حين لن يتم 5 ميثيل سيتوزين يمكن تعديلها بواسطة بيسلفيت الصوديوم ويبقى أن السيتوزين بعد التضخيم PCR (كلارك وآخرون ، 1994 ؛. فرومر وآخرون ، 1992). بعد الحصول على نتيجة التسلسل قارناه مع القالب حبلا الخاصة التي تستخدم لتضخيم PCR. إذا بقايا السيتوزين في قالب يقرأ باعتباره الثايمين في النتيجة التسلسل ، فإنه يشير إلى أن ليس لميثليته السيتوزين. إذا بقايا السيتوزين في قالب يبقى السيتوزين في التسلسل ، فإن ذلك يعني أن ميثليته والسيتوزين.
رابعا. ممثل النتائج
الشكل 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فمن السهل نسبيا لفصل جنين من السويداء ، ومعطف البذور ، لكنها مملة لفصل السويداء من معطف البذور ، وخاصة بالنسبة للبذور في مرحلة مبكرة أو منتصف الطوربيد ، من مرحلة التطور الجنيني. منذ معطف البذور يساهم سوى كمية صغيرة جدا من الأنسجة ، وبالنسبة لبعض الجينات ، مثل الشرق الأوسط وأفريقيا وFWA ، ونحن لم يكن لديك لفصل السويداء من معطف البذور. وهذا يعني أننا نستطيع عزل الرناوات من خليط من السويداء والأنسجة معطف البذور ، والتحقق من التعبير عن الأليلات الأم والأب من الجينات ، مقارنة مع التعبير في الجنين ، وتحديد وضعهم يطبع من هذا الجين.
لتسلسل بيسلفيت والاشعال مصممة يلزم حبلا محددة. في بعض الأحيان ، فإنه من الصعب تضخيم جزء من الحمض النووي الجينومي بيسلفيت المعاملة بسبب قالب الحمض النووي التي تضررت من العلاج بيسلفيت الصوديوم ، ونحن نحاول عادة مجموعات مختلفة من بادئات PCR في مختلف المناطق وأقصر الأجزاء. بعد الهضم انزيم التقييد ، الحمض النووي الجيني يجب أن يكون تماما في التشويه والتحريف ، الذين تقطعت بهم السبل واحد منذ ما يقرب من نزع الأمين بيسلفيت لا يعمل على بقايا هياكل السيتوزين في الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل. مفتاح آخر هو أن العلاج يجب أن يكون بيسلفيت كاملة. إذا لم يتم تحويل السيتوزين المعروف unmethylated لالثايمين في التسلسل بيسلفيت ، فإنه يدل على أن لا تتم معالجة بيسلفيت صحيح. بدلا من ذلك ، إذا لم يتم تغيير العديد من البقايا السيتوزين في منطقة غير معروفة لالثايمين في التسلسل بيسلفيت ، فمن الأرجح بسبب التضخيم من الحمض النووي غير محولة بدلا من الإشارة إلى جميع مخلفات السيتوزين ميثليته في المنطقة.
ويمكن للصوديوم التسلسل بيسلفيت تكشف بالضبط ما إذا كان ميثليته بقايا السيتوزين معين أو ليست في وضع الجينوم إذا أجريت التجربة بشكل صحيح (هندرسون وآخرون ، 2010). الجمع بين بيسلفيت الصوديوم التسلسل مع التقنيات الحديثة التسلسل الإنتاجية العالية ، مثل الجينوم محلل البورشيد منصة التسلسل الإنتاجية العالية ، يمكن للمرء خريطة epigenome في واحدة قاعدة القرار في النباتات والثدييات (Cokus وآخرون ، 2008 ؛. هسيه وآخرون . ، 2009 ؛ معلن وآخرون ، 2008 ؛. معلن وآخرون ، 2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب أشكر السيدة جنيفر M. وميل وتارا Rognan N. لصيانة النباتات Arabidopsis. وأيد هذا العمل من جانب صناديق المبتدئة من جامعة سانت لويس والمعاهد الوطنية للصحة منح 1R15GM086846 - 01 - 01S1 و3R15GM086846 إلى شياو دبليو.
Materials
Supplies
Reagents
|
References
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning. Nature. 452, 215-219 (2008).
- Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).
- Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation. Cell. 124, 495-506 (2006).
- Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. Accurate sodium bisulfite sequencing in plants. Epigenetics. 5, 47-49 (2010).
- Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm. Science. 324, 1451-1454 (2009).
- Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis. Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).
- Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation. Science. 303, 521-523 (2004).
- Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis. Cell. 133, 523-536 (2008).
- Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -M. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462, 315-322 (2009).
- Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA. Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).
- Rogers, S. O., &, B. endich, J, A. Extraction of DNA from plant tissues. Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. Early Flower Development in Arabídopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase. Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).
