Mit Bioluminescent Imaging, um Synergie von Untersuchen Streptococcus pneumoniae Und Influenza A Virus in Infant Mäuse

Summary

Eine gleichzeitige Infektion mit Influenza A-Virus ist einer der Faktoren bei der Induktion von invasiven Pneumokokken-Erkrankung bei asymptomatischen verwickelt

Abstract

Während der 1918 Influenza-Virus-Pandemie, die etwa 50 Millionen Menschen weltweit tötete, war die Mehrheit der Todesfälle nicht die Folge einer Infektion mit dem Influenzavirus allein. Stattdessen sind die meisten Menschen gedacht, um eine sekundäre bakterielle Infektion erlegen, vorwiegend durch das Bakterium Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) verursacht. Die synergistische Beziehung zwischen Infektionen, die durch Influenza-Viren und Pneumokokken verursacht hat in der Folge während der 1957 Asian Influenza-Virus-Pandemie beobachtet worden, wie auch bei saisonalen Ausbrüche des Virus (Übersicht in ^{1, 2).} Hier beschreiben wir ein Protokoll verwendet, um den Mechanismus (s), die in einer erhöhten Morbidität beteiligt sein können, als Folge der gleichzeitigen Influenza A-Virus und S. untersuchen pneumoniae Infektion. Wir haben ein Kind Mausmodell entwickelt, um zuverlässig und reproduzierbar zeigen die Auswirkungen des Influenza-Virus Infektion von Mäusen mit S. kolonisiert pneumoniae. Unter Verwendung dieses Protokolls haben wir den ersten Einblick in die Kinetik der Pneumokokken-Übertragung zwischen Co-untergebracht, neugeborenen Mäusen mit in-vivo-Bildgebung ³ vorgesehen.

Protocol

1. Vorbereitung der Infectious Bestand Bioluminescent S. pneumoniae

1. Impfen ein McCartney Röhrchen mit 10ml Todd-Hewitt-Bouillon mit 0,5% (w / v) Hefeextrakt und ein kleines Stück Blutagar mit Biolumineszenz S. ergänzt pneumoniae und wachsen statisch bei 37 ° C zu optischen Dichte (600nm) von 0,40-0,45.
2. Legen Sie die Kultur auf nassem Eis für 5 min auf die Zellen in dieser Wachstumsphase zu verhaften.
3. Um die 10 ml der Mitte log-Wachstumsphase S. pneumoniae 1 ml 80% (v / v) Glycerin und mischen, Aliquot in die gewünschte Volumen und bei -70 ° C.
4. Bestimmen Sie die infektiöse Dosis der Biolumineszenz S. pneumoniae Lager von Keimzahl von Verdünnungsreihen auf Blutagar-Platten.

2. Wachstum und Vorbereitung von Influenza A-Virus Lager

1. Influenza A-Virus ist in Allantoisflüssigkeit der 10-Tage-alten bebrüteten Hühnereiern gezüchtet.
2. Tauwetter ein Fläschchen mit Influenza A-Virus in 37 ° C Wasserbad.
3. Mit einer Lichtquelle in den airsac (Durchleuchtung), markieren Sie auf der Eischale die Lage der Luftsack an einem Punkt frei von zugrunde liegenden Venen platziert.
4. Desinfizieren Sie die Oberfläche der Eier durch Abreiben mit 70% Ethanol und reinigen.
5. Pierce ein kleines Loch in den Luftsack knapp über die Marke mit einem Juwelier Schreiber.
6. Mit den Eiern in einem Karton mit dem Luftsack obersten positioniert, mit einem 13mm 1ml Spritze und eine 26G Nadel jedes Ei durch das Loch in die Schale zu impfen mit 0,1 ml des entsprechend verdünnten Influenza A-Virus. Richten Sie die Nadel direkt nach unten in die Allantoishöhle, Durchstechen der airsac.
7. Dichten Sie das Loch mit geschmolzenem Wachs und brüten die Eier für 2 Tage in einem befeuchteten Inkubator Ei bei 35 ° C. Nach 2 Tagen Inkubation Kerze die Eier auf das Vorhandensein von Blutgefäßen zu überprüfen, um zu bestätigen ist der Embryo noch am Leben. Wenn das Ei innen schwarz, hat der Embryo stirbt und das Ei muss entsorgt werden und nicht für die Ernte von Influenza A-Virus verwendet.
8. Legen Sie die Eier bei 4 ° C über Nacht, um die Embryonen zu töten und zu verengen die Blutgefäße, um Störungen der Gefäße zu minimieren, da der Kontakt zwischen Blut und Viren würden bei der Bindung des Virus an roten Blutkörperchen führen.
9. Am nächsten Tag, desinfizieren die Oberfläche der Eier durch Abreiben mit 70% Ethanol.
10. Die Arbeit in der Klasse II Biosicherheitswerkbank die Allantoisflüssigkeit mit dem Influenza A-Virus aus den Eiern zu sammeln. Entfernen Sie das Wachs und die Verwendung einer gebogenen Schere, um um die Spitze des Eis geschnitten, um den Luftsack über dem Allantois-Membran zu entfernen.
11. Pannen-und abziehen der Allantois mit einer sterilen Pinzette.
12. Saugen Sie die Allantoisflüssigkeit mit einem 10 mL sterilen Pipette, während der Embryo zu einer Seite mit einem anderen sterilen Pipette. Sammeln gebündelt Allantoisflüssigkeit in 50 mL Röhrchen und halten auf Eis zu allen Zeiten. Wenn die Allantoisflüssigkeit ist blutig oder enthält Eigelb nicht an den Pool hinzufügen.
13. Centrifuge Allantoisflüssigkeit für 5min bei 2.000 min bei Raumtemperatur, um Verschmutzungen zu entfernen.
14. Aliquot der infektiösen Allantoisflüssigkeit in 1-2 ml Kryoröhrchen und bei -70 ° C.
15. Bestimmen Sie die Influenza A-Virus-Titer des aufgetauten Allantoisflüssigkeit in 3 unabhängig voneinander durchgeführt Plaque-bildenden-Assays in Madin-Darby Canine Kidney-Zellen (siehe unten). Verwenden Sie ein neues Aliquot des Virus für jedes Experiment. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen reduziert die Infektiositätstiters.

3. Intranasale Infektion von Mäusen mit Biolumineszenz S. pneumoniae und / oder Influenza A-Virus

1. Eingefrorene Bestand von Biolumineszenz S. pneumoniae und verdünnt auf gewünschten Dosis in PBS.
2. Gently abholen 5 Tage alten Mäusen zwischen Zeigefinger und Daumen und halten aufrecht. Mit einer Pipette Biolumineszenz S. drop pneumoniae auf Nasenlöcher in einem Volumen von 3μl. Warten Sie, bis alle das Inokulum, bevor Sie mit der Maus zurück in den Käfig eingeatmet wird. Verwenden Sie 3μl von PBS für Mock-Infektion.
3. Drei bis neun Tage nach Besiedelung mit Biolumineszenz S. pneumoniae, Tauwetter ein Aliquot Allantoisflüssigkeit mit Influenza A-Virus und verdünnen in PBS auf die gewünschte Konzentration. Infect Mäuse mit Influenza A-Virus in einem Volumen von 3μl PBS, wie in Schritt 3.2 beschrieben. Verwenden Sie 3μl des verwässerten Allantoisflüssigkeit von infizierten Eiern für Mock-Virus-Infektion.
4. Überwachen Sie die Wohlfahrt der Mäuse täglich durch die Beobachtung ihrer Erscheinung, Verhalten, körperliche Verfassung und in Mäusen, die ≤ 3 Tage alt sind, das Vorhandensein von Milch-Spots. Ein Leitfaden für humane Endpunkte und Intervention Kriterien sollten in Absprache mit dem Laboratory Animal Tierarzt (Tabelle 3) entwickelt werden.

4. Bioluminescent Bildgebung mit der IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences)

1. Bereiten Sie eine Mischung aus Ketamin bei 0,75 mg / ml und Xylazin 1.76mg/ml in injizierbaren Wasser.
2. Um betäuben Mäusen injiziert 100μl/10 g Körpergewicht in peritonealenHohlraum.
3. Legen Sie betäubten Mäuse in bildgebenden Feld. Besondere Aufmerksamkeit sollte hierbei auf die Beibehaltung der anatomischen Region von Interesse parallel zur Kamera beim Platzieren der Maus in der Bildgebung box / Kammer.
4. Legen Box mit Mäusen in IVIS und ermöglichen Isofluran Eintrag in das Feld bei 0,5 L / min auf die Anästhesie aufrecht zu erhalten.
5. Set IVIS Maschine Imaging-Plattform und Binning korrekte und erfassen die Grafik für 7 Minuten.
6. Lassen Mäuse von der Narkose in einer angewärmten Feld (zB mit einem Heizkissen) wieder vor der Rückkehr nach Hause Käfig.
7. Die Bilder werden analysiert und angepasst, um den gleichen Maßstab mit dem Leben Image Software-Paket Version 3.0 (Caliper Life Sciences).
8. Bioluminescent Signale in einem ausgewählten Bereich von Interesse kann entweder der gesamte Fluß (Photonen / s) oder die mittlere Strahldichte (Photonen / s / cm ² / sr) quantifiziert werden.

5. Verarbeitung von Geweben, um bakterielle Belastung und Virustiter zu bestimmen

1. Mäuse werden durch CO ₂ Erstickung eingeschläfert und das Fell desinfiziert mit 70% Ethanol.
2. Immobilisierung des Tieres auf eine harte Schneidebrett.
3. Mit einem sterilen Skalpell, Schnitt durch die Mitte der Kopf des Tieres ab posterior, und setzen die Nasopharynx durch Biegen jeder Seite des Kopfes nach außen.
4. Sammeln Sie die Nasen-Rachen-Gewebe eines jeden Tieres durch Abkratzen des Gewebes aus jeder Hälfte des Kopfes mit einer sterilen Pinzette und in 1,5 ml eiskaltem RPMI. Keep on ice.
5. Öffnen Sie den Brustkorb mit einer Schere und entfernen Sie die Lungen mit einer sterilen Pinzette und Schere. Spülen Sie den Lungen dreimal in PBS, um das Blut zu entfernen und sammeln sich in 1,5 ml eiskaltem RPMI. Keep on ice.
6. Verwenden Sie einen Homogenisator zu den Geweben zu homogenisieren, statt wieder auf Eis.
7. Nehmen Sie einen aliquoten Teil der homogenisierten Gewebe und nutzen diese, um die bakterielle Belastung zu ermitteln. Bereiten Sie serielle Verdünnungen der Gewebehomogenat und Teller auf HBA. Kultur-Platten bei 37 ° C für 18-24 Stunden und bestimmen Keimzahl. Die bakterielle Titer in einem bestimmten Organ kann dann mit der Anzahl der Photonen in dieser Region beobachtet korreliert werden.
8. Centrifuge den Rest der homogenisierte Gewebe bei 3.500 rpm für 10 min bei 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand und Transfer zum sauberen, sterilen Röhrchen. Shop Überstand bei -70 ° C und bestimmen Virustiter durch Plaque-Assay.

6. Plaque-Assay zur Influenza A-Virus-Titer in Gewebehomogenaten bestimmen

1. Virus Infektiositätstiter werden durch die Bildung von Plaque auf konfluente Monolayer von Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-Zellen bestimmt. MDCK-Zellen werden routinemäßig in RF10 (Tabelle 1) in Gewebekultur-Flaschen (Nunc) kultiviert und passagiert, wenn konfluent.
2. Lösen Sie MDCK Zellen aus Gewebekulturen Flaschen mit Trypsin. Waschen Sie die Zellen in RF10 und sammeln Zellen durch Zentrifugation bei 1200 rpm für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren die pelletierten Zellen in RF10. Zählen Sie die MDCK-Zellen mit einer Zählkammer und vital zu färben. Seed jedem 35mm sowie der 6-well-Platten (Nunc) mit 1.2x10 ⁶ MDCK-Zellen in 3ml RF10 und Kultur der Zellen bei 37 ° C und 5% CO ₂ zu erreichen Konfluenz (in ~ 24 Stunden).
3. Bereiten Leibovitz dsL15 Medien-und 1,8% (w / v) Agarose-Overlay-Medium (Tabelle 1). Aliquot dsL15 Medien-und 1,8% (w / v) Agarose in 50 mL in sterile Flaschen. Keep dsL15 Medien bei 4 ° C bis zur Verwendung und Agarose bei 56 ° C bis zur Verwendung.
4. Überprüfen Sie, dass die MDCK Zellmonoschichten konfluent sind und waschen Sie die Zellen mit RPMI + durch Absaugen des RF10 und ersetzt sie mit ~ 1,5 ml RPMI +. Zu keinem Zeitpunkt des Verfahrens sollten die Platten dürfen vollständig austrocknen. Die Inkubation bei 37 ° C bis unmittelbar vor den Proben mit Viren hinzuzufügen.
5. Bereiten Sie serielle Verdünnungen des Virus-Proben in RPMI +. Keep Proben auf Eis bis zum Gebrauch.
6. Saugen Sie RPMI + aus der Mono-und add 135uL RPMI + geeigneter Verdünnungen von Virus-Probe in jede Vertiefung. Testen Sie jede Probe doppelt.
7. Inkubieren Sie die MDCK-Zellen mit dem Virus Proben für 45 min bei 37 ° C und 5% CO _2. Schütteln Sie die Platten alle 15 Minuten, um das Virus zu verteilen und verhindern das Austrocknen der MDCK Zellmonoschichten.
8. Bewegen Sie die Agarose von 56 ° C bis 46 ° C im Wasserbad warm dsL15 Medien bis 46 ° C im Wasserbad.
9. Nach 45min Inkubation des Virus auf die MDCK Monoschichten, nehmen Platten von 5% CO _2-Inkubator. Entfernen Agarose und L15 Medien von 46 ° C im Wasserbad. Fügen Sie 0,2 ml von 0,1% Trypsin zu 50 mL der dsL15 Medien, als add 50 mL dsL15 + Trypsin auf 50 ml von 1,8% (w / v) Agarose. Mischen Sie die Agarose und L15 sanft und fügen 3 ml Overlay-Medium in jede Vertiefung der 6-well Platten. Vorsichtig schwenken, um die gesamte MDCK Zellmonolayer sicher abgedeckt ist. Sobald die Überlagerung ist inkubieren Platten bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 2-4 Tage.
10. Am Ende der Inkubationszeit, die Anzahl der Plaques als Maß der Virus infectivity. Falls erforderlich, können die Plaques werden durch Anfärbung der Monoschichten mit Kristallviolett in Methanol gelöst.

7. Abschnitt C - Geheimnisse zum Erfolg:

1 Alle experimentellen Arbeiten mit S. pneumoniae (zB Impfung von flüssigen Kulturen, der Verarbeitung von Geweben von Mäusen mit S. pneumoniae infiziert) ist eine Klasse II Biosicherheitswerkbank durchgeführt.

1.1 Wir erstellen Biolumineszenz S. pneumoniae-Stämme durch die Einführung von Plasmid pPJTG28 ^3. Doch eine Vielzahl von verschiedenen Biolumineszenz S. pneumoniae-Stämme sind 4-6. Bioluminescent S. pneumoniae-Stämme können auch von Caliper Life Sciences Inc (MA, USA) erworben werden.

1.1 Wachstum Kinetik der verschiedenen S. pneumoniae-Stämmen unterscheiden können und sollten für jeden Stamm bestimmt werden. Es kann zwischen 3-4 Stunden, um OD600nm = 0,4 bis 0,45 erreichen.

1.4 Wir würden normalerweise erwarten, dass die infektiösen Vorräte Konzentration 10E8 CFU / ml erreichen und empfehlen eine Verdünnung reichen von 10e-4 bis 10E-8 um die Konzentration von lebensfähigen Bakterien zu bestimmen.

2.6 Die entsprechende Titer für Impfen die Eier zu verwenden, hängt von der Virusstamm verwendet und kann von 10e-3 bis 10e-5-Bereich. Influenza A Virus-Stämmen aus dem Gewebe Kulturüberständen gewonnen manchmal unverdünnt eingesetzt werden.

3.2a verwenden wir routinemäßig 2.000 KBE S. pneumoniae-Stamm EF3030 zu kolonisieren 5 Tage alten Mäusen ^3. Die genaue infektiöse Dosis des Inokulums wird nachträglich für jedes Experiment durch Ausplattieren serieller Verdünnungen des Inokulums auf Pferdeblut-Agar-Platten bestimmt. Die Fähigkeit des S. pneumoniae-Stamm, um Mäuse zu kolonisieren wird zunächst durch Keimzahl von Gewebehomogenaten (zB Nasopharynx, Lunge) zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Inokulation der Mäuse bestimmt.

3.2b Es ist nicht notwendig, anaestetics verwenden, um die Bakterien oder Viren, die Tiere durch Inhalation zu verabreichen. Infant Mäuse (wie auch erwachsenen Mäusen) mit der Hand sollte eingeschränkt werden und aufrecht gehalten durch den Prüfarzt, wird das Inokulum (3 Mikroliter für Säuglings-Mäuse, bis zu 10 Mikroliter für erwachsene Mäuse) dann auf die Nasenlöcher und Inhalation ließ alle des Inokulums wird durch die Beobachtung bestätigt.

3.2c entfernen neugeborenen Mäusen eins nach dem anderen aus dem Nest und impfen mit Bakterien oder Viren, wie gebraucht. Mark den Schwanz des Tieres mit einem Permanent-Marker, wenn notwendig und kehren Tier zurück zum Käfig sofort. Rub das Tier mit einigen Einstreu, so dass der Damm wird den Welpen zurück zu akzeptieren in das Nest. Hinweis: Permanent-Marker abfärbt die Tiere schnell und muss täglich neu aufgetragen. Alternativ kann auch ein Tattoo-System verwendet, um einzelne Tiere zu identifizieren.

3.3 Wir verwenden 20 PFU Influenza A-Virus Udorn/307/72 (H3N2) zu infizieren 8 bis 14 Tage alten Mäusen 3. Mortalität und Morbidität bei den Tieren beobachtet wird auf dem Stamm von S. hängen pneumoniae und Influenza A-Virus verwendet. Tabelle 3 gibt einen nützlichen Satz humane Endpunkte und Intervention Kriterien, die bei Mäusen jünger als 21 Tage alt verwenden. Wir in der Regel nicht erkennt alle Mortalität und Morbidität bei der Verwendung von S. pneumoniae EF3030 und Influenza-A-Virusstamm Udorn/307/72 (H3N2) bei Mäusen sind> 10 Tage alt.

4.2 Um genau zu sein, kann Mäuse vor der Injektion des Narkosemittels Lösung abgewogen werden. Als Richtwert ist ca. 50-75 Mikroliter Anästhesie-Lösung für 20 Tage alten Mäusen verwendet. Die Maus ist vollständig betäubt, wenn er nicht reagiert, um eine Prise in den Schwanz oder Hinterbein. Während in den IVIS werden die Mäuse auch Isofluran, die Anästhesie hinzufügen ausgesetzt sein wird. Der Zeitpunkt der Bildgebung nach der Infektion der Mäuse ist abhängig von der Belastung (en) von S. pneumoniae und Influenza A-Virus sowie über die Symptome von Interesse verwendet werden. Performing wenigen Pilotversuchen auf den Zeitpunkt der Biolumineszenz Imaging optimieren kann notwendig sein.

4,3 Mäuse können entweder in eine isolierte Box (die verhindert, dass Verunreinigungen Betreten oder Verlassen der Box) platziert werden oder alternativ kann direkt in das Gerät für die Bildgebung gestellt werden. Wir verwenden die Isolierung Feld für Experimente mit Mäusen Säugling, um sicherzustellen, dass die Mäuse bleiben während der bildgebenden Verfahren betäubt und eine Verunreinigung des IVIS mit S. zu verhindern pneumoniae und / oder Influenza A-Virus.

4.3 Verwendung einer ventralen Bild der Mäuse, um ein Bild der Atemwege zu erhalten. Eine seitliche Bild der Maus sorgt für eine sensiblere Bild von den Ohren.

4.4 Bei Mäusen direkt in die Kammer eingebracht wird Isofluran geliefert, um die Mäuse über Bugspitzen. Für Experimente, in denen Säugling Mäusen verwendet werden, ist die Isolation Box bevorzugt, da die Nase Kegel nicht über Säuglingsanfangsnahrung Mäuse passen.

4.5 Ter insgesamt Belichtungszeit benötigt, um ein Bild zu erfassen kann zwischen den Experimenten nach der Stärke der Biolumineszenz-Signal variieren, Standort des Signals, Bakterienstamm und die Maus-Stamm verwendet. Bei letzteren können sowohl Pigment und Fell deutlich dämpfen die gesamte nachweisbare Signal. Die Kamera auf der IVIS Spectrum ist ein Back-ausgedünnt, hinten beleuchtet CCD bietet einen breiten dynamischen Bereich (65536 Graustufen). Idealerweise sollte die Belichtungszeit einstellen zwischen 60 und 60.000 zählt zu erfassen. In unserer Erfahrung mit C57BL / 6 Mäusen, die Erhöhung der Belichtungszeit über 7 Minuten nicht merklich verbessern das Signal-Rausch-Verhältnis. Alternative Möglichkeiten zur Erhöhung der Biolumineszenz-Signal gehören die Erhöhung der Grad der Binning (dh zu groß) und mit einem kleineren Sichtfeld. Wichtig ist, dass die Quantifizierung nicht auf Bereiche innerhalb des Bildes mit gesättigten Pixel durchgeführt werden, da dies ein unterschätzter Wert für die Anzahl der Photonen nachgewiesen werden. Wenn Sie unsicher sind, um die optimalen Bedingungen kann die Belichtungsautomatik Funktion als Richtlinie verwendet werden.

4.5 Wenn eine starke Biolumineszenz-Signal in einem Teil der Maus ist behindert die Detektion von Biolumineszenz in einem nahe gelegenen Region, in ausgewählten Regionen der Maus mit schwarzem Papier und Bildgebung kann abgedeckt werden kann als normal gehen

4.7 Bei der Lumineszenz-Signal wird in Photonen (im Gegensatz zu zählt Gegensatz) Variationen in der bildgebenden Bedingungen (z. B. bildgebende Zeit) zwischen den Experimenten keinen Einfluss auf die Messung der Biolumineszenz-Signal quantifiziert.

4.8 Wenn mit dem gesamten Fluss der Photonen in einem bestimmten Bereich zu messen, sicherzustellen, dass die gleichen "region of interest"-Form für alle Proben verwendet wird.

5.1a Mäuse können zu jedem Zeitpunkt nach der Infektion mit Influenza A-Virus eingeschläfert werden, je nach Interesse der Forscher. Wir bestimmen üblicherweise bakterielle und virale Titer bei 6 Tage nach der Infektion mit Influenza A-Virus Udorn/307/72 (H3N2) und halten sich nicht an jedem Mortalität / Morbidität. Allerdings wird Morbidität und Mortalität bei diesen Experimenten beobachtet variieren je nach S.pneumoniae und Influenza A-Virus-Stamm und der Zeitpunkt chosed sollten Mortalität und Morbidität zu berücksichtigen, die Auswirkungen auf den Tierschutz zu minimieren. Tabelle 3 gibt einen nützlichen Leitfaden zur Intervention Kriterien und humane Endpunkte für den Einsatz in diesen Experimenten. Generell sind Mäuse euthanasiert und Gewebe verarbeitet, wie innerhalb von 3 Stunden nach der In-vivo-Biolumineszenz Bildgebung beschrieben.

5.1b Mäuse jünger als 10 Tage alt sind resistent gegen Hypoxie und sind durch Enthauptung getötet. In der beschriebenen Versuchsanordnung, sind Mäuse mindestens 14 Tage alt und kann durch CO ₂ Erstickung eingeschläfert werden.

5,7 Blut-Agar-Platten können mit 5μg/ml Gentamicin ergänzt werden, um das Wachstum von symbiotischer Bakterien in Homogenaten von Nasalgewebe verhindern. Die Palette der verwendeten Verdünnungen werden auf der S. hängen pneumoniae-Stamm verwendet. Für Experimente in 20 Tage alten Mäusen mit S. pneumoniae-Stamm EF3030, verwenden wir ordentlich, 10e-1, 10e-2 und 10e-3.

5,8 Shop jede Probe homogenisiert Gewebe in mindestens zwei Portionen, so dass ein Backup-Probe zur Verfügung, falls das Virus Plaque-Assay nicht ist! Eine genaue virale Titer kann nur aus einer Probe einmal nach dem Einfrieren, aber nicht von den Proben immer wieder aufgetaut einfrieren aufgetaut eingeholt werden.

6.1 Bei gewachsen 90-100% konfluent, wird eine einzelne 150cm ^{2-Gewebekultur-Kolben} genug MDCK-Zellen für fünf 6-well Platten ergeben.

6.5 Die optimale Verdünnungsreihe auf den Virusstamm verwendet und die Zeit nach der Infektion ab. Normalerweise würden wir ordentlich, 10e-1 und 10e-2 Verdünnungen für Orgel Homogenaten 6 Tage nach der Infektion mit Influenza A Virus getroffen verwenden.

6.6 Benutzung der seriellen Verdünnungen von Virus Lager ist eine entsprechende positive Kontrolle für den Einsatz in jeder Plaque-Assay. Als Negativ-Kontrolle, kann RPMI + verwendet werden.

8. Repräsentative Ergebnisse:

Abbildung 1. Schematische Darstellung des bebrüteten Hühnerei.

Abbildung 2. BLI von S. pneumoniae infizierten Maus an Tag 3 und Tag 4 nach Mock Infektion mit Influenza-Virus.

Abbildung 3. BLI von S. pneumoniae und Influenza-Virus-Infektion der Maus an Tag 3 und Tag 4 nach der Infektion mit Influenza-Virus.

Abbildung 4. Bakterielle Belastung in der Nase eines Einzel-und Co-InfektionenTed Maus.

Abbildung 5. Virustiter in der Nase und Lunge eines co-infizierten Maus.

Medien	Inhalt
1,8% (w / v) Agarose	Fügen Sie 0,9 g Agarose auf 50 ml destilliertem H 2 O, durch Autoklavieren bei 121 ° C für 10 Minuten zu sterilisieren. Übertragen auf 56 ° C im Wasserbad abkühlen.
Doppelte Kraft Leibovitz L15 Medium (ds L15)	1 Tasche von L15-Pulver (um bis 1L) wird in 450 ml sterilem destilliertem H 2 O gelöst und bis zur Auflösung gerührt. Der pH-Wert auf pH 6,8 mit 1 M HCl eingestellt. Dann mit 4 ml von 7% (w / v) NaHCO3, 0,4 ml HEPES (0,5 M, pH 6,8), 200 U / ml Penicillin, 200 ug / ml Streptomycin, 60 pg / ml Gentamicin zu ergänzen. Passen Endvolumen von 500 ml und Filter zu sterilisieren.
Pferdeblut-Agar (HBA)	4% HBA (Oxoid, Basingstoke, UK), dH 2 O, 7% (v / v) Pferdeblut
RF10	RPMI-1640 mit 2 mM Glutamin, 2nM Natriumpyruvat, 24 g / ml Gentamicin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 10% (v / v) hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum.
RPMI +	RPMI-1640 mit 2 mM Glutamin, 2nM Natriumpyruvat, 24 g / ml Gentamicin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin
Todd-Hewitt Broth + 0,5% Hefeextrakt	Todd Hewitt-Bouillon (Oxoid, Basingstoke, UK) in dH 2 O ergänzt mit 2% (w / v) Hefeextrakt

Tabelle 1. Specific Media in diesem Protokoll verwendet.

Material Name	Typ	Firma	Katalog-Nummer	Kommentar
RPMI Medium 1640	Reagens	Gibco	21870-076
Trypsin	Reagens	Worthington Biochemical Corporation	LS003740	TPCK behandelt
Leibovitz L-15-Medium	Reagens	Gibco	41300-039
Agarose, Typ I	Reagens	Sigma-Aldrich	A6013	Verwenden Sie niedrige Schmelztemperatur Agarose, wie SeaPlaque Agarose
Madin-Darby Canine Kidney-Zellen	Reagens	ATCC	CCL-34

Tabelle 2 Spezifische Reagenzien und Geräte.:

Auswirkung auf den Tierschutz
	Leichte bis moderate unterzeichnet	Schwere Zeichen b
Nicht-spezifische Zeichen (s):
Aussehen	Leichte bis Piloerektion ohne Dehydratation (Haut Zelten) moderate	Piloerektion, mit Dehydratation (Haut Zelten)
Body Condition	verminderte Gewichtszunahme	Keine Gewichtszunahme oder Reduktion des Gewichts
Behaviour	Gedämpft, aber reagieren, verringerte Interaktion mit Gleichaltrigen.	Nicht mehr auf Aktivität und Provokation. Isoliert von anderen Geschwistern
Besondere Bedingungen oder abnorme klinische Zeichen (s):
Das Fehlen von Milch vor Ort (<2-3 Tage alt)	Versuchen Sie zu ermutigen, Spanferkel, wenn dies für <24 Stunden beobachtet.	Wird kein Nachweis von Milch vor Ort auch mit der Förderung nach dem 24-48h, oder wenn offensichtlich noch nicht gestillt, sollten Euthanasie.
Andere Zeichen	Suchen Tier Facility Manager / Versuchstierkunde Tierarzt beraten re: geeignete Maßnahmen oder einschläfern, wenn Tier ist in mittlerer oder schwerer Schmerzen oder Leiden

Tabelle 3. Intervention Kriterien für die Säuglings-Mäusen (<21 Tage alt):

^a Wenn eine oder mehrere "leichte bis mäßige" Zeichen beobachtete Zunahme Häufigkeit der Beobachtungen zu zweimal täglich und konsultieren Sie Ihren Tierschutzbeauftragten gegebenenfalls so, dass die Behandlung und Pflege gegeben werden kann.

^b Wenn ein oder mehrere "schwere" Anzeichen beobachtet werden, einschläfern die Mäuse mitgeeignete Methode. Mäuse <10 Tage alt sind durch Enthauptung getötet, Mäuse> sind 10 Tage alt von CO ₂ Ersticken getötet.

Discussion

In-vivo-Bildgebung mit dem IVIS Maschine ist eine einzigartige Methodik, die die Echtzeit-Visualisierung der mikrobiellen Pathogenese ^{4, 6-9} ermöglicht. Hier zeigen wir die Anwendung dieser Technologie für das Verständnis der Synergismus zwischen S. pneumoniae und Influenza-Virus in Säuglings-Mäusen. Aufgrund der nicht-invasiven Charakter dieser Technik haben wir in der Lage, das Fortschreiten der Infektion in einzelnen Maus im Laufe der Zeit zu überwachen. Dies hat uns ermöglicht, die Kinetik der Pneumokokken-Übertragung unter Zusammenarbeit untergebracht Säugling Mäuse ^3-Dokument. Die nicht-invasive Natur dieser Technik ermöglicht es Forschern, weniger Tiere pro Versuch verwenden und so zu verringern Tierversuchen. Es ist auch möglich, die IVIS Maschine benutzen, um die Verbreitung der Infektion, bisher unbekannte Seiten der Infektion im Körper sichtbar zu machen, sowie Websites, die nicht einfach durch Dissektion (wie Mittelohr) abgetastet.

Vor Beginn der bildgebenden Experimenten bestätigten wir, dass die Kolonisierung Ebenen der Biolumineszenz EF3030 Belastung vergleichbar Kolonisierung Ebenen der Muttergesellschaft EF3030 Belastung durch die Aufzählung Keimzahl in Gewebehomogenaten wurden. Darüber hinaus haben wir zunächst bestätigt, dass eine Infektion mit Influenza-Virus führte zu einer erhöhten Belastung der Biolumineszenz EF3030 in den Nasenrachenraum von besiedelten Tieren als mit den Eltern EF3030 Stamm (Ergebnisse nicht gezeigt) nachgewiesen.

Während die IVIS Technologie ist einfach zu bedienen und erzeugt reproduzierbare und einfach, Daten zu verstehen, müssen Experimente sorgfältig entworfen werden, so dass die Empfindlichkeit und die Nützlichkeit der Technologie maximiert wird. Zum Beispiel ist die Empfindlichkeit der Kamera IVIS durch die Tiefe und die Deckkraft des Gewebes ^8, die in unserer Erfahrung, erhöht sich die Nachweisgrenze für Biolumineszenz-Signale aus der Lunge betroffen. Darüber hinaus reduziert dunkles Fell und pigmentierter Haut Lichtdurchlässigkeit um mehr als 10-fach (verglichen mit haarlosen Mäusen) ^8. Während der Entwicklung dieser Methode haben wir dieses Protokoll für den Einsatz mit 5 bis 14 Tage alte C57BL / 6 Mäuse optimiert und seit bewiesen, dass IVIS verwendet werden, um Kolonisierung von 20 Tage alten C57BL / 6 Mäuse mit Biolumineszenz S. erkannt werden pneumoniae EF3030. Allerdings kann Signalerkennung erhöht, wenn diese Experimente in nude oder BALB / c Mäusen durchgeführt werden. Dennoch stellt die IVIS Kamera einen neuartigen Ansatz zur Überwachung, zu charakterisieren und schließlich verstehen die in vivo Entwicklung von Pneumokokken-Erkrankungen nach Influenza A-Virus-Infektion.