Purificazione semplificata del DNA plasmidi da culture procariotiche

Summary

Questo protocollo è un'alternativa conveniente per chiarimenti efficiente parallelo e purificazione del DNA plasmidico da

Abstract

Noi descriviamo il processo completo di piastre Advance AcroPrep filtro per 96 preparazioni plasmide, a partire dalla cultura procariotiche e termina con il DNA ad alta purezza. Sulla base multi-bene di filtrazione per la clearance lisato batterico e purificazione del DNA, questo metodo crea un processo semplificato per la preparazione del plasmide. Piastre filtranti a base di silice contenente i media possono essere facilmente lavorate per filtrazione sotto vuoto o centrifughe per produrre notevoli quantità di DNA plasmidico. Analisi quantitative determinare il DNA plasmidico purificato è sempre di alta qualità con una media di OD _260/280 rapporti di 1.97. Nel complesso, i rendimenti plasmide offrire DNA più puro per applicazioni a valle, come la sequenza e la clonazione. Questo metodo semplificato di utilizzo Piastre Advance Filter AcroPrep consente l'elaborazione manuale, semiautomatica o completamente automatica.

Protocol

1. Liquidazione lisato

1. Crescere E. culture coli trasformato con DNA plasmidico desiderato in profondo piastre (1 ml di coltura / pozzetto) in brodo Luria con antibiotico appropriato overnight a 37 ° C con agitazione.
2. Pellet di E. coli in piastra di coltura a 5.000 xg per 10 minuti, poi decantare il surnatante.
3. Risospendere ogni pellet in 100 microlitri Resuspension Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 mg / ml RNasi A).
4. Aggiungere 100 microlitri Lysis Buffer / e (200 mM NaOH, 1% SDS) e agitare utilizzando con agitazione per 2 minuti.
5. Aggiungere 100 l / pozzetto tampone di neutralizzazione (3,0 M acetato di potassio, pH 5,5) e agitare per 2 minuti.
6. Trasferimento lisato cellulare di lisato piastra chiarimenti.
7. Inserire la piastra di DNA vincolante sulla parte superiore di 350 microlitri e piastra di raccolta posto sul fondo del collettore di aspirazione. Assemblare collettore di vuoto (vedi Figura 1).
8. Luogo chiarimenti piastra lisato sulla parte superiore del dispositivo vuoto.
9. Applicare il vuoto a 10 pollici Hg (0,34 bar) e raccogliere filtrato nella piastra di legame al DNA. Non utilizzare a vuoto superiore a 12 in Hg. (0,41 bar).
10. Smontare collettore di aspirazione. Mettere 2 ml di raccolta dei rifiuti nella piastra inferiore di apparecchi.

2. DNA Binding

1. Spostare la piastra di legame del DNA alla parte superiore del collettore (vedi figura 2).
2. Aggiungere 300 microlitri Buffer / e Binding (6 M guanidina-HCl) e pipettare su e giù per mescolare.
3. Applicare il vuoto [~ 5 pollici Hg (0,17 bar) per il vuoto lenta] e scartare filtrato. Il DNA è ora associato alla membrana.
4. Lavare con 400 microlitri / pozzetto di soluzione di lavaggio (80% etanolo).
5. Applicare il vuoto, poi scarta il filtrato. Eliminare inutili se si usa 2 Piastra raccolta ml o filtrando direttamente da perdere.
6. Ripetere il lavaggio una volta.
7. Fondo macchia di piastra di filtraggio sul tovagliolo assorbente ad asciugare.
8. Applicare il vuoto ancora una volta per 5-10 minuti per assicurare la rimozione di residui di alcool.
9. Blot fondo per assicurare la rimozione di goccioline etanolo.

3. Eluizione del DNA

1. Aggiungere 70 microlitri / e tampone di eluizione (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Se la concentrazione di DNA si desidera più, il volume può essere ridotto a 50 microlitri / bene, ma la resa media totale sarà inferiore.
2. Incubare la piastra a temperatura ambiente per un minuto.
3. DNA purificato può essere eluito sia vuoto o centrifugazione.
4. Metodo vuoto: Inserire la piastra di raccolta pulita (DNasi, RNasi free) nel collettore di aspirazione. Piastra posto del filtro sulla parte superiore del collettore di aspirazione, applicare vuoto a 15 pollici Hg (0,5 bar) per 1 minuto fino a quando tutti i buffer di eluizione è passato attraverso la piastra di legame al DNA. Raccogliere DNA purificato (vedi figura 3).
5. Metodo di centrifugazione: purificazione piastra Luogo filtro sulla parte superiore della piastra di raccolta pulita e centrifugare a 1000 xg per 5 minuti.

4. Analisi quantitativa e qualitativa

1. Misura _260/280 OD, calcolare la concentrazione di DNA purificato.
2. Effettuare analisi di gel di agarosio del PDNA purificato.

5. Rappresentante Risultati

E. coli lisato chiarificato mediante centrifugazione tradizionali e Pall AcroPrep Advance Piastre chiarimenti lisato Filtro mostrato sensibile riduzione di detriti da materiale di partenza. (Figura 4).

DNA plasmidico a tre concentrazioni è stata aggiunta in TE buffer e passato attraverso la piastra di chiarificazione Advance AcroPrep lisato filtro. Un confronto tra concentrazione di DNA plasmide, pre-e post-filtrazione, mostra ~ 100% di recupero (Figura 5) in tutti e tre concentrazioni.

Per dimostrare il recupero di DNA da E. chiarito coli lisato, il DNA plasmidico è stata aggiunta in lisato grezzo e successivamente chiarificati mediante filtrazione. Lo stesso DNA plasmidico è stato aggiunto alla filtrazione seguenti lisato cellulare. Elettroforesi è stata eseguita su aliquote di ciascun campione (Figura 6). Un singolo, banda chiara di intensità simile da ciascun campione dimostra poca o nessuna perdita di DNA durante la filtrazione basata fase di chiarificazione.

Culture di E. coli contenente DNA plasmidico pCAT sono state purificate da E. coli lisati con Pall 350 microlitri e 1 ml di DNA Piastre vincolante filtro, così come altri due marchi di 350 piastre DNA microlitri vincolanti. Tutte le purificazioni sono state eseguite come specificato nel protocollo raccomandato dal produttore. La più alta concentrazione di DNA e di resa totale sono visti da Pall 1 Anticipo ml DNA piastra AcroPrep purificazione filtro (Figura 7 e Tabella 2).

Sebbene concorrente W mostra anche ad alta concentrazione di DNA (155 ng / mL), la resa del DNA totale è il più basso (4,7 mg / pozzetto) a causa del volume di ripristino bassa, ~ 30 microlitri. Concorrente M ha dato la più bassa concentrazione di DNA in 108 ng / mL, con un rendimento totale di 5,6 mcg / bene.

Agarose analisi gel di DNA purificato pCAT dalle tre piastre DNA diversi vincolante è mostrato nella Figura 8. Ogni volume campione raccolto è stato rettificato a 65 microlitri di correggere le differenze nel volume di ripristino prima di elettroforesi. Tutti i campioni mostrano superavvolto DNA plasmidico, ma resa DNA da ciascuna delle piastre del filtro varia.

La figura 9 mostra il DNA preparato è tutto in forma e ha superavvolto concentrazione simile.

Figura 1. Assemblea dei Collettore sottovuoto per il chiarimento lisato.

Figura 2. Assemblea dei Collettore sottovuoto per l'associazione del DNA.

Figura 3. Assemblea dei Collettore sottovuoto per l'eluizione sotto vuoto.

Figura 4. Filtrazione semplifica la chiarificazione del campione. Campioni triplice copia di 300 ml di lisato grezzo chiarito filtrazione sotto vuoto (350 microlitri Advance AcroPrep piastra lisato chiarimenti filtro) o centrifugazione tradizionali. OD ₃₂₀ misurati prima e dopo il chiarimento.

Figura 5. Pieno recupero di PDNA dopo passaggio piastra Advance filtro AcroPrep lisato chiarimenti. 300 microlitri di buffer TE spillo con pCAT a 25, 50 e 100 mg / ml. Concentrazione di DNA e di recupero può essere calcolato da OD ₂₆₀ prima e dopo la filtrazione, N = 2.

Figura 6. Recupero del DNA pCAT dopo chiarimenti. La stessa quantità di pUC19 spillo in lisato prima o dopo la precisazione, poi diluito 1 a 10 in tampone TE. Caricato 2 microlitri / corsia su gel di agarosio 1,2%.

Figura 7. Maggiore resa DNA plasmidico per bene con il DNA pall Advance AcroPrep vincolante piatto filtro rispetto alle piastre concorrente. PCAT resa DNA plasmidico (OD ₂₆₀₎ con indicato piatti purificazione del DNA con 1 ml (Pall e M concorrente) o 1,5 ml (concorrente W) di ​​cultura durante la notte DH5α. Purificazione mediante protocollo raccomandato produttore piastra. Barre di errore indicano l'errore standard (n> 6).

Figura 8. Gel di agarosio analisi del DNA purificato pCAT sulla piastra del DNA indicato vincolanti. 1,2% gel elettroforesi di agarosio del PDNA purificato. Campioni riuniti da tre purificazioni separati, eluato regolata a 65 microlitri dopo la depurazione, diluito 1:10. Caricato 2 microlitri per corsia.

Figura 9. Qualità e il recupero di dna puro simili quando i metodi centrifuga o per vuoto vengono utilizzati per la raccolta finale elettroforesi gel agarosio eluato del PDNA purificato. Protocollo raccomandato dal produttore per Piastre Advance AcroPrep filtro è stato seguito per la purificazione PDNA. Eluizione è stata eseguita da centrifugare a 1000 xg per 5 minuti o per vuoto con 15 pollici Hg (0,5 bar) per 2 minuti.

Discussion

Descriviamo un facile, protocollo semplificato di Piastre Advance Filter AcroPrep che offre diversi vantaggi. Questo metodo fornisce la massima produzione di DNA plasmidico quando trattati in formati AcroPrep manuale, semiautomatica o completamente automatica Advance. Un pre-filtro integrato sulla piastra spazio lisato fornisce la filtrazione costante di campioni, anche quelli contenenti livelli elevati di particolato. La geometria e dei risultati piatto più veloce, i tassi di filtrazione più uniforme in tutto il piatto con il minimo volume di hold-up, e la geometria della punta di uscita fornisce un flusso diretto di campioni in piastra ricevitore senza preoccupazioni di contaminazione incrociata. È importante sottolineare che la membrana ad alta capacità di legame nel piatto legame del DNA di Piastre Advance AcroPrep filtro è ottimizzato per il recupero massimo di DNA di alta qualità plasmide.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AcroPrep Advance Filter plate	Pall Corporation	PN 8175 (1 mL) or PN 8075 (350 µl)	3 μm glass fiber 0.2 μm Supor® membrane for clarification
AcroPrep Advance Filter Plate	Pall Corporation	PN 8132	for DNA Binding
Vacuum manifold	Pall Corporation	PN 5017
Vacuum pressure pump	Pall Corporation	PN 13157