Summary
우리의 부정적인 선택 시스템의 개발을보고
Abstract
Entamoeba histolytica은 amebiasis의 원인이되는 에이전트이며, 세계 인구의 10 %까지 감염. 유전자 표현의 위 - 아래로 규제를 활성화 분자 기술은 안정적으로 유지 plasmids의 transfection에 의존하고 있습니다. 이들은 Entamoeba의 독성 요인 우리의 이해를 증가하지만, 용량은 역방향 유전학 실험,이 기생충의 연구에 큰 이점 될 수있는 것이다 게놈로 외인성 DNA를 통합할 수 있습니다. 이 유기체에 의해 제공 도전 상동 재조합 이벤트와 transfected trophozoites에서 플라스미드 DNA episomal 치료 난이도에 대해 선택하는 무능력을 포함합니다. 외인성 DNA, 타고난 게놈 통합 이벤트가 발생하는 trophozoites의 식별의 주요 문제에 대한 높은 배경으로 나중에 발생합니다. 우리는 효모 사이 토신의 deaminase 및 유라실 prodrug 5 - fluorocytosine (5 - FC)과 phosphoribosyl transferase 키메라 (FCU1)와 선택의 형질 표현에 따라 부정적인 선택 시스템의 개발을보고합니다. FCU1 효소는 독성 5 - fluorouracil, 5 - fluorouridine - 5' - monophosphate. E.으로 무독성 5 FC로 변환 FCU1을 표현 histolytica 라인 제어 변형에 비해 prodrug에 더 민감한 30 배 이상으로 발견되었다.
Protocol
1. Entamoeba histolytica에 FCU 부정적 선택 시스템
- 벡터 제어 라인 (HM1 / pKT3M) 및 실험 라인 (HM1/pKT3M-FCU1)은 이전에 설명한 기법 1,2에 의해 생성되었습니다. 종자는 T - 25 flasks에 재고 튜브에서 연구하에 라인 TYI - S - 33 3 중간 적절한 항생제 (12 μg / ML G418)을 추가하여 선택을 유지합니다. flasks, 37에서 성장 16~18시간 후 70-80% 합류해야 ° C.
- 따뜻한 TYI - S - 33 중간에 5 Fluorocytosine (5 - FC, 시그마)의 새로운 50mM 주식 솔루션을 준비합니다. 와동이 엄격하게 몇 분 동안 완전히 5 FC를 해산합니다. 필터 - 필터 소독 0.22 μm의를 통해 전달하여 주식 솔루션을.
- 3~5분 위해 얼음에 flasks를 삽입하고 실온에서 5 분 200xg에 centrifuging하여 세포를 수집하여 수확 trophozoites. 신선한 TYI 매체에서 펠렛을 Resuspend하고 세포를 계산합니다.
- 전형적인 실험 설계 1 ML의 최종 볼륨에 48 잘 접시 잘 당 0.5 X 10 4 세포를 사용하며, 각 시험 조건에 대한 세중의 반복. 또한, 형광 측정을 촉진하기 위하여, 별도의 접시는 시점마다 각 변형에 사용됩니다.
- 각 시험 5 - FC 농도, 세중의에 대해 잘 당 종자 0.5 X 10 4 세포. TYI 매체에서 항생제 선택 압력을 유지합니다. 지금 5 - FC 주식 솔루션과 각 잘하는 trophozoites의 필요한 금액을 추가합니다.
- 37 무산소 가방에 접시를 품어 ° C.
2. 선택 효율성의 결정
- 2 MG / DMSO에 셀 추적 녹색 CMFDA (Invitrogen)의 ML 주식 솔루션을 준비합니다. 작업 솔루션 주식 혈청 무료 TYI 매체 1000 배 희석하기 위해.
- trophozoite 문화 접시에서 완전히 매체를 제거하고 150 μL 혈청 무료 TYI 포함 CMFDA로 바꿉니다. 37 배양을 계속 ° C 1 시간을 위해.
- 우물에서 염료 솔루션을 제거하고 Spectramax M2 microplate의 spectrofluorometer에서 접시를 참조하십시오. 여기 파장은 492 nm의에서 설정하고 형광 방출 517 NM에서 읽을 수 있습니다.
- 테스트 transfectants 대 제어 세포에 대한 형광 값을 비교합니다.
- 각 시간 간격에 접시를 읽고 계속합니다. 각 플레이트에 적절한 양의 (TYI 전용)과 부정 (25 μg / ML hygromycin) 제어 우물을 사용합니다.
3. 대표 결과
E. histolytica의 transfectants는 코돈 최적화 재조합 FCU1 (그림 1)의 강력한 표현을 보여주었다.이 프로토콜은 E.의 선택 제거에서 결과가 제대로 따라하면 0.5 MM 5 fluorocytosine의 존재에 FCU1을 표현 histolytica 세포. 제어 세포는 반면 5 - FC 5 MM의 농도에서 정상적으로 자라서 72 96 시간 사이의 합류에 도달 계속 (그림 2 - A). 치료 우물이 현미경으로 볼 때 48 시간에 FCU1지고 세포가 완전히 lysed 있습니다. 샘플 다수 (그림 2 - B)를 포함하는 양적 연구에서 사용되는 중요한 염료 CMFDA, 물들일 때 이들은 또한 형광 감소 보여줍니다. FCU1/5-FC 시스템 E.위한 효과적이고 강력한 부정적인 선택 도구 histolytica은 trophozoites.
그림 1. E. 생성 부정적인 선택 마커를 표현 histolytica HM1 transfectants
(A) 재조합 단백질 FCU1는 안티 - C Myc 항체 (상단 패널)을 사용하여 서양 얼룩을 발견했다. 예상했던대로, 42kDa 밴드는 아니지만 혼자 벡터 제어 transfectants의 FCU의 transfectants에서 총 lysate에서 (화살표로 표시) 감지 수 있습니다. 하단 패널은 같은 얼룩이 로딩 제어로 안티 굴지 항체와 탐지 보여줍니다. (B) 정량 실시간 PCR의 결과 lgl4 제어하는 표준 FCU1 특정 mRNA의 표현을 보여주는.
E. 그림 2.에서는 체외 마약 감도 부정적인 선택 마커를 표현 histolytica의 transfectants
(A) 제어 transfectants 및 (b) FCU1 표현 transfectants 48 - 잘 판에 교양의 생존 곡선. 세포의 증가 농도의 존재에 재배되었던 prodrug - 5 - fluorocytosine, X - 축에 표시된로 세포 생존을 각 시간 간격으로 CMFDA의 얼룩에 의해 계량했다. Y - 축 단위 형광을 나타내고 살아있는 세포 인구의 직접적인 반영이다. FCU1 표현 transfectants가 컨트롤에 비해 0.5mM prodrug 농도에 큰 감도를 보여주는 점에 유의하십시오. 대한 세포는 COM 이러한 우물에 120h 시점에서 관찰되지 않았습니다현미경 해당 컨트롤 우물 (데이터가 표시되지 않음)에서 본 합류 성장 앞에 서. Hygro는 대조군으로 사용 25μg / ML hygromycin를 나타냅니다.
Discussion
Entamoeba 분자 생물 학적 도구에서 상당한 진보가 있었다고했지만 유전자 4 삭제하거나 혼란 사용할 수있는 현재의 방법은 없습니다. 유전자 특정 표현의 최저는 RNA 6 방해 작은 헤어핀 RNAS 5의 사용에 의해 달성하고 bacterially dsRNA 7 표현되었습니다. 각각의 대상 유전자에 대한 효과적인 동시에 그러나 이러한 방법은 비용이 많이 드는 화학 물질, 항생제에 대한 지속적인 선택과 시간이 지남에 따라 발생 복귀의 높은 발병률 (알리샤 린포드, 개인 통신) 8으로 인해 지속적인 검증에 대한 필요성의 사용 등 여러 가지 제한이 있습니다.
DNA 복제 9 기원에 대한 엄격한 순서 요구 사항이 분명이 아니므로 모든 플라스미드는 Entamoeba에 복제할 수 있습니다, 그래서 한번 transfected, 그것은 보통 플라스미드 치료하기가 어렵습니다. 이것은 재조합과 유전자 녹아웃 실험에 그대로 plasmids의 가능한 사용을 제한합니다. 부정적인 선택 마커들은 재조합 subpopulations을 제거하는 데 사용할 수있는 방법을 대상으로 유전자의 핵심 구성 요소입니다. 우리는 성공적으로 코돈을 표명한 것은 Entamoeba histolytica에 FCU1 유전자를 최적화하고 부정적인 선택 마커로서의 가능성을 테스트했습니다. 이 유전자 융합은 인간의 종양 세포의 자살 유전자 치료에 사용되며 RNA 및 DNA 합성 억제에 10 결과 독성 하류 제품에 prodrug 5 - FC를 대사되었습니다. FCU1 최근 Plasmodium 다른 protozoan 기생충에 부정적인 선택 마커로 사용되고 있습니다. FCU1을 표현 Plasmodium berghei 세포는 5 - FC와 함께 체외 및 생체내 치료의 prodrug으로 거의 1000 배 더 민감한 것으로 발견된의 99.9 % 이상 죽였다 말라리아 11 erythrocytic 단계 마우스 모델에서 재조합 기생충 감염. E.가 FCU1을 표현 histolytica 전지는 P.에서 관찰 감도 달리 prodrug 5 FC에만 30 배 증가 감도를 보여주었다 berghei. 이런 경우에 대한 가능성이있는 이유는 독성 metabolites와 경쟁의 성장 매체에서 사용 가능한 세포핵의 대형 수영장 수 있습니다.
P. 모두 berghei와 P. falciparum FCU1 마커는 타겟 유전자 장애에 사용되었습니다. 연구 11,12. 우리는 상동 재조합을 사용하여 Entamoeba의 게놈을 조작하는 것을 목표로하고 있습니다. FCU1/5-FC 부정적인 선택 시스템의 검증은 이러한 목표를 향한 중요한 단계입니다.
Disclosures
이 비디오의 제작이 문서에서 사용되는 시약의 일부를 생산 시그마 알드리치, Inc의 후원했다.
Acknowledgments
우리는 FCU1 유전자의 순서와 함께 우리를 제공하는 닥터 필립 업스 감사하고 싶습니다. 이 작품은 NIH 부여 AI 26649에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TYI-S-33 medium | ATCC | Reference included in the text | |
| 5-Fluorocytosine | Sigma-Aldrich | F7129 | |
| Cell tracker green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| Spectra Max M2 plate-reader | Molecular Devices |
References
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