Summary
שילוב של טכניקות שונות על מנת למקסם את איסוף הנתונים מרקמות העכבר מוצג.
Abstract
הולך מעבר פונקציה גן יחיד לחתוך עמוק יותר לתוך רשתות גנים רגולטוריים דורש מוטציות רבות בשילוב בעלי חיים אחת. ניתוח כזה של שניים או יותר מהגנים צריך להיות כהשלמה עם ב הכלאה באתרו של גנים אחרים, או אימונוהיסטוכימיה של חלבונים שלהם, גם כל האיברים המתפתח או חלקים רכוב לפתרון מפורט של השינויים ביטוי תאית רקמות. שילוב של שינויים גן מרובים מחייב שימוש cre או flipase כדי למחוק תנאי גנים ולהימנע הקטלניות עובריים. תוכניות רבייה חובה לשפר באופן דרמטי את המאמץ ואת העלות ביחס ישר במספר גנים שעברו מוטציה, עם תוצאה של חיות מעט מאוד עם הרפרטואר המלא של שינויים גנטיים הרצוי. Amortizing כמות עצומה של מאמץ וזמן כדי להשיג דגימות אלה יקר מעט, כי הם נושאים מוטציות רבות מחייב אופטימיזציה של רקמות. יתר על כן, חוקרת בעלי חיים אחד עם טכניקות מרובות מקלה לתאם המחיקה ליקויים גן עם פרופילי הביטוי. פיתחנו טכניקה כדי להשיג ניתוח מעמיק יותר של חיה מסוימת, את היכולת לנתח כמה מבנים לזיהוי בהיסטולוגיה שונים, כמו גם ביטוי גנים וחלבונים מן כל דגימה זהה בשני האיברים רכוב קטעים שלמים. אמנם בעכברים כבר נוצלו כדי להדגים את האפקטיביות של טכניקה זו הוא יכול להיות מיושם על מגוון רחב של בעלי חיים. לשם כך אנו משלבים lipophilic צבע העתקה, הר שלמה הכלאה אימונוהיסטוכימיה באתרו, ו היסטולוגיה כדי לחלץ את סכום מקסימלי אפשרי של נתונים.
Protocol
1. הזרקת דיי lipophilic
רקמות אופן ההכנה:
והניתוחים כל רקמה ומניפולציות מבוצעות בבעלי חיים קבוע paraformaldehyde 4% (PFA) במאגר M 0.1 פוספט (pH 7.4) על ידי זלוף transcardial באמצעות משאבות peristaltic עם מחטים בגודל מתאים. רקמות ניתן לאחסן PFA 4% במקרר עד 6 חודשים. כל ההכנות ומניפולציות נערכים 0.4% או יותר עד PFA גובר עם גליצרול הדמיה. זו כמות PFA ביעילות מבטלת RNases ושומרת על רנ"א עבור ב הכלאה באתרה.
דיי אחסון:
צובעת כל יש לאחסן בתא סגור חשוך כדי למזער את זרימת האוויר ואת החשיפה לאור יום בהיר, כפי שהם רגישים לאור. כדי למנוע זיהום לחצות, סט נפרד של מכשירים יש להשתמש כדי לטפל בכל צבע.
- ראשית, האתר בקשה צבע חייב להיבחר ורקמות זרים חילוץ כדי חזותית לאשר את האתר הנבחר, וגישה עבור מיקום של הצבע. בחירת אתר יישום הוא השלב החשוב ביותר בתהליך זה. בחירת אתר טוב התווית האוכלוסייה העצבית הנדונה ולא מבנים זרים יכול להיות מאתגר. הדיוק של המיקום לתוך מערכת נתונה תחת שליטה חזותית בהיקף לנתח דורש רמה מסוימת של הבנה של neuroanatomy הנדון. דאי יכול להיות ממוקם באופן מרכזי או שולי תווית תחזיות היקפי או מרכזי צורך בהתאמה כמו לפרויקט מסוים (כלומר, המוח, העצבים ההיקפיים, אוזניים, עיניים). צבעים Lipophic יהיה מפוזר בכל התהליכים השייכים נוירון נתון, הן retrogradely ו anterogradely, מילוי נוירון נתון או כל הנוירונים מקרין לתוך מסלול נתון.
- NeuroVue צבע מן MTTI מגיע טעון מראש על רצועות מסנן עבור יישום קל. דאי יכול גם להיות מומס DMSO 100% (עבודה מתחת למכסה המנוע) ו שיער דליל יכול להיות טבול הפתרון הזה מיובשים לאחר מכן עבור יישומים קטנים יותר. לצבוע מראש נייר סינון לחתוך לחתיכות בגודל מתאים משולש עם microscissors. גודלו של צבע יהיה תלוי בגודל הדגימה, גודל המבנה להיות מתויג, ואת מספר הצבעים בשימוש בו זמנית. הקפידו לחתוך קטן כמו של פיסת ככל האפשר כדי למנוע תיוג ומבנים אחרים. לאחר השימוש microsissors לחיתוך מלקחיים לטיפול לצבוע להתסיס את המכשירים אלכוהול כדי להסיר שאריות צבע, אז אוויר יבש לחלוטין, או טיפה עם נייר. זה כדי למנוע לזהם את הדגימה עם צבע שיורי על מכשירים שעשויים תווית מבנים לא רצויים.
- עבור הכניסה לתוך רקמות רכות כגון המוח מסנן יכול להיות מוכנס ישירות באמצעות נקודה של המשולש לסנן לרקמה לחדור. עבור רקמות נוקשה יותר לעשות חתך כדי לאפשר החדרה קלה יותר של צבע. אין להשתמש איזמל המנתחים לדחוף לסנן לתוך הרקמה. זה יכול לגרום לשיבוש מיקום מדויק של הרקמה. הכנס אורכי גל חלופיות NeuroVue צבען לפי הצורך עבור תיוג של אוכלוסיות נוירונים נוספים.
- לאחר הוספת צבע, ואימות עמדתה, דגימות ממוקמים בקבוקון סגור היטב עם PFA 4% ו מודגרות ב 36 ° C בחושך במשך 2-14 ימים בהתאם לגיל ומרחק דיפוזיה להיות מכוסה (כ 2 מ"מ לכל היום בשעה 36 ° C).
- היקף לנתח עם epiflouresence ניתן להשתמש כדי להעריך אם יש לצבוע מתפזרת אל המיקום הרצוי, ואת הדגימה ניתן להציב בחזרה בחממה אם דיפוזיה נחשבת מספיקה. שימוש היקף הניתוחים נורמלי ללא epifluorescene לזהות דיפוזיה יהיה לזלזל אורך נכון לצבוע יש מתפזרת. כמו כן, אם ריכוז לצבוע גבוה מספיק כדי התחת חזותית הוא עלול לגרום מרווה ספיגת הקרינה הנפלטת בעת שימוש.
- הרקמה הרצויה של הריבית גזור החוצה כולו מותקן על גבי שקופית עם גליצרול coverslipped עבור דימות באמצעות מיקרוסקופ confocal. הגדרות Confocal הם כמתואר 1, 2. אם גודל רקמות מעכב כל הרכבה בשקופית, חתך סדרתי נדרש (ראה להלן). פרטים נוספים על ההכנות של רקמת עבור דימות ספקטרלי ותכונות צבע זמינים בכתובת: http://www.mtarget.com/mtti/documents/NeuroVuebrochuremar2010.pdf
באיור 1. סקירה סכמטי של הניסוי. האוזן חשוף כדי לאפשר הדמיה של מבנים כל. לצבוע lipophilic מוזרק אז מותר מפוזר. לאחר דיפוזיה באוכלוסיות עצביות שונות ניתן לראות שכותרתו על ידי צבעים שונים. לאחר מכן, הכלאה באתרו (Sox2) מבוצע על האוזן ותוויות ביטוי ה-mRNA. אימונוהיסטוכימיה מבוצעת לאחר מכן החוצה(Myo7, טובולין) לדמיין ביטוי חלבון. ואחריו סעיפים היסטולוגית שבה הן הכלאה אימונוהיסטוכימיה באתרו ניתן דמיינו.
2. באתרו של הכלאה
במקרה אתה רוצה להתחיל עם ב הכלאה באתרו (לאחר מעקב עם צבעים lipophilic יהיה בלתי אפשרי), עיין הכנת הרקמה חלק 1. לשטוף כל, אלא אם צוין, מתבצעת עם 2 מ"ל של תמיסת בטמפרטורת החדר על מהפך / מיקסר. הקפד לעבוד בסביבה נקייה RNase, בחינם.
- מייבשים ואז רעננותם דגימות באמצעות סדרה מתנול מדורגים.
- 100% 1 שעה לילה @ 4 ° C (לא חובה: דגימות חנות ב -20 מעלות צלזיוס מתנול 100%)
- 75% x 5 דקות. @ 4 ° C
- 50% x 5 דקות. @ 4 ° C
- 25% x 15 דקות. @ 4 ° C (או עד כיורים רקמה)
- העברת דגימות של 2 מ"ל Eppendorf צינור (RNase חינם).
- לשטוף שלוש פעמים PBS (1x PBS) ולהפוך את התנור על הכלאה לשימוש עתידי (60 ° C).
- PBS x 5 דקות.
- PBS x 5 דקות.
- PBS x 5 דקות.
- תקציר רקמה עם μL 2 של 20 מג / מ"ל מניות proteinase K (חתול Ambion # AM2546) ב 2.0 מ"ל טרי PBS.
זמן בפועל העיכול PK תלוי גיל העובר. להלן אומדן גס של פעמים. עיכול צריך להיות פיקוח הדוק כמו deproteination הוא שלב קריטי. תת העיכול תגרום חדירה בדיקה העניים בעוד יתר העיכול תגרום לאובדן של שלמות מבנית. אינדיקטור טוב של מערכת העיכול הוא שינוי ברקמת מאטום כמעט ברור.טבלה 1. Proteinase K זמן העיכול על רקמות העכבר. גיל (יום עובריים) זמן (דקות) E8.5 6 E9.5 10 E10.5 13 E11.5 15 E12.5 17 E14.5 18 E16.5 + 20 + - עצור לעיכול על ידי דוגרים דגימות PFA 4% עבור 5 דקות.
- שטפי ב PBS.
- PBS x 1 דקות.
- PBS x 5 דקות.
- PBS x 5 דקות.
- PBS x 5 דקות.
- בטל PBS תשומת לב מיוחדת כדי לחסל כמה שיותר.
- Prehybridize דוגמאות: דגירה ב 60 ° C על מהפך בתמהיל 1.8 מ"ל הכלאה במשך שעה לפחות 1. הגדר לחסום IsoTemp חום עד 85 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
- בתור אחד שעה מתקרב, סלמון לפגל זרע DNA (Invitrogen חתול מספר 15632-011) על ידי הדגירה על 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הגדר על הקרח עד לשימוש.
- אחרי שעה לפחות 1 של prehybridization, להוסיף 200 ssDNA מפוגל μL ו 100ng של כ riboprobe-DIG שכותרתו מדגם זה. להכליא בין לילה ב 60 ° C בתנור הכלאה.
- החלף לערבב הכלאה עם 2 מ"ל 2X SSC. הגדר חוסמת IsoTemp חום 37 מעלות צלזיוס ו 70 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
- לשטוף עם דקות 2X 10 x SSC. @ 60 ° C בתנור הכלאה.
- לשטוף עם דקות 2X 10 x SSC. @ 60 ° C בתנור הכלאה.
- לשטוף עם דקות 2X 10 x SSC. @ 60 ° C בתנור הכלאה.
- לשטוף עם דקות 2X 60 x SSC. @ 70 מעלות חום לחסום IsoTemp.
- לשטוף עם PBS 5 דק 'x. הפשירי RNase האנזים על הקרח לשימוש עתידי.
- החלף PBS ולהוסיף 1.0 μL של אנזים RNase (Fermentas EN0531 10 מ"ג / מ"ל) x 60 דקות. @ 37 מעלות חום לחסום IsoTemp (90 min. תקופת הדגירה היא המועדפת אם בדיקה מרוכז מאוד).
- בטל PBS / RNase לשטוף 4 פעמים.
- 1X פתרון לשטוף x 10 דקות.
- 1X פתרון לשטוף x 10 דקות.
- 1X פתרון לשטוף x 10 דקות.
- 1X פתרון לשטוף x 60 דקות. @ 70 מעלות חום לחסום IsoTemp.
- מדגירים את הצפת 1X חסום במשך שעה 1.
- בשלב זה, להכין 2.0 מ"ל של חיץ לחסום 1 μL (1:2000) Anti-Digoxigenin נוגדן לדגימה. היפוך בקצרה ולתת לשבת 4 ° C עד השימוש.
- לאחר 1 שעה חיץ להשליך בלוק ומוסיפים 2.0 מ"ל מראש נספג חיץ לחסום + נוגדנים דגימות.
- דגירה בין לילה.
- בטל פתרון לחסום.
- לשטוף עם חיץ 1X לשטוף.
- 1X לשטוף חיץ x 5 דקות.
- 1X לשטוף חיץ x 5 דקות.
- 1X לשטוף חיץ במשך שעה 1 x 5-6 שינויים.
- לשטוף עם חיץ 1X לשטוף לילה.
- לשטוף עם 1X detection חיץ עבור 10 דקות.
- העברת הדגימות במאגר זיהוי הצלחת היטב.
- הסר חוצץ לזהות עם BM סגול (רוש 11442074001) עד עוצמת האות הרצוי מתקבל (עם בדיקות יותר זה כנראה אומר לילה). BM סגול היא לכסות בנייר כסף רגישים לאור או קופסה.
- מערבבים BM סגול היטב לפני השימוש.
- ודא כי דגימות צפים חופשית לא נדבק בארות.
- בדוק אות אחרי שעה 1.
- לשטוף עם דגימות למאגר זיהוי 1X ב 5 דקות בארות x.
- תמונה או דגימות חנות PFA 4% ב 4 ° C.
* דוגמאות ניתן הדמיה בשלב זה ו / או לאחר השלב אימונוהיסטוכימיה נוסף (חלק 3 להלן).
פתרונות:
- Nuclease מים חינם: מערבבים 1 מ"ל DEPC (סיגמא) עם 1 ליטר מים ultrapure סטרילית. החיטוי.
- 1X PBS: מערבבים 1 PBS מנות (Sigma) 1 ליטר מים חינם nuclease ולסנן לעקר.
- 1X פתרון שטפי: מערבבים 450 מ"ל מים nuclease חינם + 50 מ"ל פתרון לשטוף לסנן 10x ו לעקר.
- מערבבים Hybridization: לפוראמיד 50% לפי נפח (25 מ"ל); 50% 2X SSC לפי נפח (25 מ"ל); 6% סולפט dextran ידי המסה (דור 3).
- 1X מאגר זיהוי: 50 מ"ל מערבבים חיץ 10X זיהוי עם 450 מ"ל מים חינם nuclease ולסנן לעקר.
- 1X הצפת בלוק: 10X 5 מ"ל הצפת Maleic חומצה (רוש לקבוע חיץ); 40 מ"ל מים nuclease חופשית; 5 הצפת 10X מ"ל חסום.
- 2X SSC: לערבב 50 מ"ל 20X SSC עם 450 מ"ל מים חינם nuclease ולסנן לעקר.
- מתנול מדורגים: 100% מתנול מדולל במים nuclease חופשי 75%, 50% ו 25% בריכוז.
3. אימונוהיסטוכימיה
שלבים 1 ו -2 ניתן להשמיט אם חלק 2 הושלמה. במקרה זה, לוודא שכל גליצרול או בינוני הרכבה השני הוא לשטוף. שים לב שלא כל הנוגדנים עדיין יהיה מסוגל לזהות epitope שלהם לאחר עיכול K proteinase. יש לנו רשימה קצרה של נוגדנים, שניתן להשתמש בהם בשילוב עם ב הכלאה באתרו ברקמות יונקים כפי שהם שומרים על הייחודיות שלהם (ראה טבלה 2).
- סדרת אתנול מדורגים להיפטר רקמה של צבעים lipophilic (אם לא השלים את אפקט חלק 2):.. 5min אתנול 50%, 70% 5 דקות אתנול, 95-100% אתנול צורך הלילה או עד האפקט הרצוי, אתנול 70% 5 דקות., 5min אתנול 50%.
- רעננותם באופן הדרגתי על ידי הוספת PBS ב 5-10 דקות.
- בלוק רקמה שעה 1 ב -2.5% עז בסרום נורמלי (NGS) ו 0.5% Triton X-100 @ RT על שייקר.
(01:01 NGS 5%: 1.0% TritonX-100 ב 1x PBS) - דגירה עם נוגדן ראשוני (ים) מדולל פתרון לחסום 48-72 שעות @ 4 ° C על שייקר.
- לשטוף עם PBS עבור x 1 שעות 3 שינויים.
- בלוק כמו בשלב 3.
- דגירה עם נוגדנים משני (ים) מדולל פתרון לחסום עבור 12-24hrs @ 4 ° C על שייקר (אלקסה פלואוריד צבעים ® מן Invitrogen היו בשימוש).
- שטפו כמו בשלב 5. (אפשרות:.. נגד כתם עם כתם Hoechst גרעיני כמו ליטול ידיים לדלל 10 מ"ג / מ"ל מניות 1:2000 ב PBS פעל עם 1 hr שוטף ב PBS x 2-3 שינויים RT @ על שייקר)
- הדמיה: דוגמאות ניתן הדמיה בשלב הזה עם הילוכים וגם במיקרוסקופ epifluorescent, מעדיפים באמצעות מערכת הדמיה confocal לפתרון הוסיף. לשם כך אנו אוזניים באופן שגרתי הר שלם גליצרול באמצעות coverslips כמו מפרידי להימנע על דחיסה של הרקמה. בנוסף או במקום הדמיה הזה הר שלמה, דגימות יכול להיות מוטבע בתוך שרף אפוקסי מחולק סדרתי לפרטים היסטולוגית הוסיף. כדי ליהנות מן ניתוח משולב הר / קטע שלם, למנוע הלבנת אות ניאון בשלב הדמיה confocal.
פתרונות
- אתנול פתרונות: 100% אתנול מדולל במים מזוקקים לריכוזים סופי של 50% ו -70%.
- הפתרון בלוק: 01:01 NGS דילול 5%: 1.0% TritonX-100 ב 1x PBS (ריכוזים עובד סופי: NGS 2.5%, 0.5% TritonX-100).
- 1X PBS: מערבבים 1 PBS מנות (Sigma) ב 1 ליטר מים מזוקקים.
- 5% NGS: הפשירי 2.5 NGS מ"ל ומערבבים עם 47.5 מ"ל 1x PBS. חנות ב 4 ° C.
- 1.0% TritonX-100: ערבבו 49.5 מ"ל 1x PBS עם 0.5 מ"ל TritonX-100 (להשאיר על שייקר RT @ לערבב במשך שעה 1). חנות ב 4 ° C.
- Hoechst פתרון מניות כתם: להמיס 10 מ"ג Hoechst לצבוע למיליליטר של 1x PBS.
| טבלה 2. נוגדנים הפועלים עם רקמה K proteinase מעוכל. | ||
| חתול # | פריט | מוכר |
| 25-6790 | Anti-שרירן-VIIA polyclonal | פרוטאוס Biosciences |
| 25-6791 | Anti-שרירן-VI polyclonal | פרוטאוס Biosciences |
| 9661 | ביקע caspase-3 polyclonal | תא האיתות |
| T7451 | Anti-Acetylated טובולין Monoclonאל | סיגמא |
| PRB-238C | Polyclonal Prox1 | Covance |
4. היסטולוגיה
היסטולוגיה ניתן שהוכנסו לאחר חלק 1 להגדיל את הרזולוציה של הצבע lipophilic התחקות ב mounts שלם עבה כמו מוחות צעירים או לאחר השלמת חלקים 2 או 3. עבור חלקים במוח סדרתי אנו ממליצים על VF-700 Compresstome microtome (Precisionary מכשירים בע"מ, גרינוויל, צפון קרוליינה) כדי להשיג עובי סעיף אחיד. חלקים קפואים הם אופטימליים פחות בשל זליגת צבע יותר בתהליך חתך 3. הכנת חלקים סדרתי גובר גליצרול 4 היא השיטה המועדפת של הכנת הרקמה כולה או כאשר עולה עולה לפני השטח אינן מאפשרות ראיה מספקת של רקמות באזורים של עניין. רקמות יכולים גם להיות מוטבע לאחר מכן שרף אפוקסי וחותכים את עובי 1-2 מיקרומטר באמצעות סכינים זכוכית או יהלום TEM. כאשר משתמשים בטכניקה זו ביותר immunofluorescence יישאר והוא גם יציב יותר לאחר הטבעה הפלסטיק, עם זאת, מעקב אחר כל lipophilic יאבדו לחלוטין בשלב זה כפי שהם נמסים באלכוהול שרף אפוקסי. קח זהירות כמו דגימות יהיה רגיש לאור עד שהם מוטבעים.
עבור חתך Compresstome VF-700 microtome, בצע את המלצות Precisionary מכשירים בע"מ
אפוקסי והטבעה / חתך:
- קיבוע: 2.5% gluteraldehyde / PFA 1% ב 0.1M פוספט חיץ (pH 7.4) 1 שעות עד לילה.
- בתוך רקמת זכוכית מדגם מייבשים בקבוקון: אתנול 30% (5min.), אתנול 50% (5min.), אתנול 70% (עד 5min. לילה), אתנול 95% (10min 5x כל אחד.) ואתנול המוחלט (10min 5x . כל אחד).
- מעבר מרכך: 01:01 אתנול אבסולוטי: פרופילן אוקסיד (PO) במשך 5 דקות.
- מרכך: 10min 5x רק PO. כל אחד מהם.
- הסתננות עם שרף:
- 01:01 ת.ד.: לילה שרף על שייקר.
- יוצקים פתרון עם דגימה (ים) לתוך תבנית שטוחה לעזוב הטבעה על 4-6 שעות דלפק להתאדות PO. לחילופין, להסיר את המכסה של הצנצנת ולהשאיר על שייקר במשך 4 שעות (עובד היטב עם רקמה גדולה יותר).
- העברת דגימות שרף 100% במשך 4 שעות.
- שבץ שרף עובש הסופי עם תווית. לפלמר ידי דוגרים על 60 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות.
- גזור לחסום בסכין גילוח הדרוש כדי למזער שרף זרים. חותכים סעיפים 1-2 סדרתי אממ על Ultramicrotome (E-Ultracut רייכרט יונג היה בשימוש). הר התמונה באמצעות מיקרוסקופיה epifluorescent.
אופציונלי: כתמים חלק חלקים עם כתמים היסטולוגי (כלומר של Stevenel כחול) אם רוצים (מבין immunofluorescence לא יהיה ממושך בסעיפים אלה).
פתרונות
- פתרונות אתנול: 100% אתנול מדולל במים מזוקקים עד 30%, 50%, 70% ו 95% בריכוז.
- פתרון קיבוע: 2.5 מערבבים Gluteraldehyde מ"ל 50%, 5 Paraformaldehyde מ"ל 10% ו 42.5 מ"ל 0.1M פוספט pH 7.4 חיץ (ריכוזים סופי: gluteraldehyde 2.5%, 4% PFA). חנות ב 4 ° C.
- שרף אפוקסי: הפוך על פי ההוראות המצורפות פולי / מיטה קיט 812 והטבעה Media/DMP-30 (Polysciences, Inc # 08792-1). חנות ב -20 ° C.
5. נציג תוצאות
איור 2. מיקום לצבוע הדמיה lipophilic והן לעובר בעכבר. שלושה צבעים אורך גל שונה lipophilic הוזרקו וטופחו על מנת לאפשר הדמיה של העצב המשולש (TN), עצב glossopharyngeal (GN), ואת העצב התועה (VN) תחזיות המרכזית. א) מיקום לצבוע lipophilic לחלקים ההיקפיים של שלושת עצבי הגולגולת כדי לאפשר דיפוזיה אל גזע המוח להדמיה של תהליכים מרכזיים שלהם. TN התווית NeuroVue האדום, GN: בורדו NeurVue ו VN: Jade NeuroVue. ב) עכבר זהה לאחר דגירה (A). דיפוזיה חלקם ניתן לראות במיקרוסקופ brightfield. ג) עכבר זהה (A ו-B). למוח האחורי כבר גזור ועלה שטוח. תיוג חלק מן התהליכים המרכזיים של שלושת העצבים שכותרתו ניתן לראות במיקרוסקופ brightfield. D) תמונה של Confocal (C). עם השימוש של נוירונים ספציפיים confocal ניתן לראות, ושימוש של שלושה צבעים שונים מאפשרת הערכה של התפלגות אוכלוסיית כל ביחס לאחרים. צבעים הם צילמו ברצף. ג'ייד NeuroVue היה צילמו בשעה עירור של 488 ננומטר פליטת 500-550 ננומטר. NeuroVue האדום צילמו בשעה עירור של 535 ננומטר פליטת 550-600 ננומטר. בורדו NeuroVue היה צילמו בשעה עירור של 643 ננומטר פליטה ב 650-700 ננומטר.
איור 3. סקירה סכמטי של הניסוי. האוזן חשוף כדי לאפשר הדמיה של מבנים כל. לצבוע lipophilic הואמוזרק אז מותר מפוזר. לאחר דיפוזיה באוכלוסיות עצביות שונות ניתן לראות שכותרתו על ידי צבעים שונים. לאחר מכן, הכלאה באתרו (Sox2) מבוצע על האוזן ותוויות ביטוי ה-mRNA. אימונוהיסטוכימיה מבוצעת לאחר מכן החוצה (Myo7, טובולין) לדמיין ביטוי חלבון. ואחריו סעיפים היסטולוגית שבה הן הכלאה אימונוהיסטוכימיה באתרו ניתן דמיינו.
Discussion
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את השיטה לשלב ארבע טכניקות על מנת למקסם את איסוף הנתונים על ידי לכידות correlating נתונים בתוך חיים נתון (איור 3). גישה זו תפחית את כמות רבייה ולכן הזמן הדרוש כדי להשיג נתונים, תוך שיפור לפרסום מידע אודות לוקליזציה שיתוף ואפקטים המתאם של מוטציות. למרות עכברים עובריים נוצלו בעכבר הווידאו הזאת, מבוגרים, כמו גם בעלי חיים אחרים כגון עוף, xenopus, ואת דג הזברה ניתן לנתח באמצעות טכניקות אלה גם כן. בעת שימוש מינים אחרים העיכול proteinase k ייתכן שיהיה צורך לשנות. כאן אנו משתמשים בצבעים שונים NeuroVue fluorescing במיוחד כדי התווית עד שלוש אוכלוסיות נוירונים של עניין. היתרון של צבעים אלה היא שהם ניתן להשתמש בעכברים מוטנטים, אשר עשוי להיות בעייתי כאשר להסתמך רק על אימונוהיסטוכימיה כי עשויה או לא עשויה להיות מושפעת על ידי מוטציות להיות מנותח, והם תווית נוירונים retrogradely ו anterogradely 5. מחקר שנערך לאחרונה גדל גם מספרם של אוכלוסיות נוירונים שיכולים להיות מתויג בו זמנית לשישה 2. לאחר, לצבוע lipophilic מתווים את הרקמה באותו עניין אז יכול להיות מנותח משתמש הכלאה באתרו, לניתוח של שעתוק הגנים ניתן לנתח לאחר מכן באמצעות אימונוהיסטוכימיה להפצה חלבון. הניתוח האחרון ניתן להוסיף על ידי היסטולוגיה מפורט אשר יכול להוסיף ואפיון פנוטיפ 6. זה ניתוח multifactorial יש פוטנציאל תובנות חדשות באמצעות ניתוח המתאם בתוך החיה אותו שעלולים להיות סבירה אחרת או לפחות בצורך של פרוטוקולים יותר נרחב הרבייה העכבר.
Disclosures
רקמה עכבר נאסף בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי האוניברסיטה של טיפול בבעלי חיים איווה מוסדיים ועדת שימוש (ACURF 0,804,066).
Acknowledgments
תמונות Confocal התקבלו באוניברסיטת איווה קארבר המרכז הדמיה. המימון ניתן על ידי מענק SBIR (MH079805) כדי לתמוך BF נוסף לגידול עכברים עבור פרויקט זה סופק על ידי NIDCD (5R01DC00559007) ל BF
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| in situ Hybridization: | |||
| PC DIG wash + block buffer set | Roche Group | 1585762 | |
| Premix 20x SSC Buffer | Roche Group | 1666681 | |
| Proteinase K 20mg/ml | Ambion | AM2546 | |
| Diethyl Pyrocorbonate (DEPC) | Research Products International Corp. | D43060 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Dextran Sulfate | Research Products International Corp. | D20020 | |
| BM Purple | Roche Group | 11442074001 | |
| Anti-Dig-AP Fab fragments | Roche Group | 11093274910 | |
| RNase A enzyme 10mg/ml | Fermentas | EN0531 | |
| RNase Away | Research Products International Corp. | 7003 | |
| Salmon Sperm DNA 10mg/ml | Invitrogen | 15632-011 | |
| Stericup Filter Unit 0.22μm; 500ml | EMD Millipore | SCGVU05RE | |
| Filter Discs 0.2μm; 25mm | Whatman, GE Healthcare | 6780-2502 | |
| Phosphate buffered saline PH 7.4 packets | Sigma-Aldrich | P-5368 | |
| Immunohistochemistry: | |||
| Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| H–chst Dye | Polysciences, Inc. | 9460 | |
| Histology: | |||
| Poly/Bed 812 Embedding Media/DMP-30 Kit | Polysciences, Inc. | 08792-1 | |
| Propylene oxide | Sigma-Aldrich | 110205 | |
| Gluteraldehyde Solution 50% | Fisher Scientific | G151 | |
| DPX Mountant | Fluka | 44581 | |
| Rocker | MidSci | 55D1114 | |
| Heat Block | Fisher Scientific | 11-715-125D | |
| Rotator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 400110Q | |
| Incubator set to 60° | Fisher Scientific | 11-690-625D | |
| Dye tracing: | |||
| Microscissors | Geuder | G-19775 | |
| Fine Forceps | E.M.S | 72680-F | |
| NeuroVue dye: Maroon, Red, Jade | MTTI | FS-100(1,2,6) | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P-5368 | |
| Dissecting scope | Leica Microsystems | M205 FA | |
| Incubator set to 36° | Fisher Scientific | 11-690-506DQ | |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | LSM 510 | |
| Slides | Surgipath | 00240 | |
| Coverslips | Surgipath | 00106 | |
| RPI | Glycerol | G22025-0.5 | |
| Paraformaldehyde (4% and 0.4%) | Fisher Scientific | T353-500 |
References
- Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes. Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).
- Tonniges, J. Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing. Journal of Microscopy. , (2010).
- Bartheld, C. S. von, Cunningham, D. E., Rubel, E. W. Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis. J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).
- Gurung, B., Fritzsch, B. Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection. J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).
- Fritzsch, B., Nichols, D. H. DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice. Hear Res. 65, 51-60 (1993).
- Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea. PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).
