התפתחות מוקדמת של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מאופיינת במספר שינויים בצורת התא כי הם גם מתאים גישות הדמיה. מאמר זה יתאר כלים בסיסיים ושיטות הדרושים הדמיה confocal חיים של עוברים תסיסנית, יתמקד בשינוי צורת התא הנקרא cellularization.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
העובר המתפתח תסיסנית melanogaster עובר מספר שינויים בצורת התא כי הם נוחים מאוד לחיות הדמיה confocal. צורת התא שינויים לטוס מקבילים לאלה של יצורים עילאיים, והם כונן המורפוגנזה רקמות. לכן, במקרים רבים, המחקר שלהם יש השלכות ישירות להבנת מחלות אנושיות (טבלה 1) 1-5. בסולם המשנה הסלולר, אלה שינויים בצורת התא הם תוצר של פעילויות, החל ביטוי גנים על התמרה האות, קוטביות התא, שיפוץ cytoskeletal וסחר הממברנה. לכן, את העובר תסיסנית מספק לא רק את ההקשר כדי להעריך שינויים בצורת התא ככל שהם מתייחסים המורפוגנזה רקמות, אלא גם מציע סביבת פיזיולוגיים לחלוטין ללמוד את המשנה הסלולר פעילות תאים לעצב.
הפרוטוקול המתואר כאן נועד תמונה תאים מסוים לשנות צורה נקרא cellularization. Cellularization הוא תהליך של צמיחה פלזמה דרמטי קרום, וזה בסופו של דבר ממיר את העובר סינסיציאלי לתוך blastoderm הסלולר. כלומר, בכל שלבי הביניים של מחזור mitotic 14, הממברנה הפלסמטית בו זמנית invaginates סביב זה של גרעינים 6000 ~ מעוגן cortically ליצור גיליון של תאים אפיתל העיקרי. בניגוד להצעות קודמות, cellularization אינו מונע על ידי contractility שרירן-2 6, אבל היא מונעת בעיקר על ידי במקום exocytosis של קרום מחנויות פנימי 7. לפיכך, cellularization היא מערכת מצוינת ללימוד סחר קרום במהלך שינויים בצורת התא הדורשים הממברנה הפלסמטית invagination או הרחבה, כגון cytokinesis או רוחבי, אבובית (T-אבובית) המורפוגנזה בשריר.
שים לב שזה פרוטוקול מוחל בקלות הדמיה של אחרים שינויים בצורת התא בעובר לעוף, רק דורש הסתגלות קלה כגון שינוי בשלב של איסוף העובר, או באמצעות "דבק העובר" על מנת לטעון את העובר בכיוון טבלה ספציפיים ( 1) 8-19. בכל מקרה, זרימת העבודה הוא בעצם אותו דבר (איור 1). שיטות תקן שיבוט תסיסנית transgenesis משמשים להכנת מניות לעוף יציב המבטאים חלבון של עניין, התמזגו חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או על גירסאותיה, וזבובים אלה מהווים מקור מתחדש של עוברים. לחלופין, חלבוני ניאון / בדיקות מוצגים ישירות באמצעות הזרקת מיקרו פשוט טכניקות 9-10 לעוברי לעוף. ואז, תלוי במקרה התפתחותיים שינוי צורת התא להיות צילמו, עוברים נאספים מבוים על ידי המורפולוגיה על מיקרוסקופ לנתח, ואת מיקומו ולבסוף ועלה הדמיה זמן לשגות על מיקרוסקופ confocal.
פרוטוקול
1. להרכיב אוסף כוסות עובריים
- חותכים את החלק התחתון של כוס 100 מ"ל Tri-תירס עם סכין, מה שהופך את קצה כפי חלקה ככל האפשר. כוסות קל יותר להתמודד אם גם לקצץ את שלוש פינות הנחה של העליון, אם כי זה לא הכרחי.
- חותכים ריבוע של רשת תיל (6 ס"מ X 6 ס"מ). על צלחת מראש חימם חם, בתוך שכבת עשן מכסה המנוע, הכיכר של רשת התיל על גבי פיסת נייר אלומיניום עבות. לחצו על תחתית לחתוך בתחתית הספל בחוזקה על רשת החם. חכו כמה שניות, להרים את הכוס עם רשת המצורפת עכשיו. אם לסכל את גם מקלות, פשוט לקלף אותה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול המתואר במסמך זה יאפשר הדמיה לחיות, confocal של מספר שינויים בצורת התא בעובר המתפתח לעוף. מניות ה-GFP הדמיה יכול להיות מוכן על ידי מעבדה הפרט (טבלה 2), אך מניות רבות כאלה זמינים גם בפומבי ממרכזי כגון Bloomington תסיסנית במלאי מרכז באוניברסיטת אינדיאנה ( http://flystocks.bio.indiana.edu ) ו פרח מלכודת במלאי מרכז באוניברסיטת ייל ( http://flytrap.med.yale.edu ). רכשה לאחר נתונים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
בהכרת תודה אנו מודים אריק Wieschaus, שסיפק את הבסיס שעליו בפרוטוקול זה פותחה. העבודה שלנו היא נתמכת על ידי ורנה & Marrs מקלין המחלקה לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית פרס Start-up, ביילור לרפואה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שקופיות | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| זכוכית כיסוי 25x25 | Fisher Scientific | 1 2-524C | |
| בקבוקי התזה (H2סגירת המעגל (O) | Fisher Scientific | 02-897-11 | |
| מבחנות פלקון (Falcon) בנפח 50 מ"ל | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| נבובות לשאיבה עבור פיפטות קטנות, 1 מ"ל | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| בקבוקוני סינשילציה עם פקקים | VWR international | 66021-533 | |
| ביכרי Tri-Corn, 100 מ"ל | מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית | 60970 | |
| צלחת פטרי BD Falcon בגודל 60x15 מ"מ | Fisher Scientific | 08757 100B | |
| מסנן תאים BD Falcon | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| טיפי פ pipette צהובים | Rainin | L200 | |
| רשת פלדת אל-חלד, 304, 12x24 | Small Parts, Inc. | CX-0150-F-01 | |
| זכוכית 5¾ פיפטות פסטור בגודל 6 אינץ' | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| נייר סינון P4 | Fisher Scientific | 09-803-6F | |
| גומיות | Office Max | A620645 | |
| סרט דביק דו-צדדי של Scotch, ½ אינץ' | Office Max | A8137DM-2 | |
| מכחולי צבע Robert Simmons Expression מסדרת E85, עגולים, מספר 2 | ג'רי’Artarama | 56460 | |
| פינצטה Dumont #5, דיוק גבוה, Inox | מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית | 72701-DZ | |
| להבי תער | VWR international | 55411-050 | |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | H 8773 | |
| הפטאן | Fisher Scientific | H360-1 | |
| BD Bacto Agar | VWR international | 90000-760 | |
| סוכרוז | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| חומצה p-הידרוקסיבנזואית | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| שמרים יבשים פעילים של Red Star | LeSaffre | 15700 | |
| נייר סופג, קיפולי C | Kleenex | ||
| נייר אלומיניום עמיד (Heavy duty) | נייר אלומיניום (Reynolds Wrap) | ||
| חומר הלבנה | אוסטון’A-1 מסחרי | ||
| 100% מיץ תפוחים | Ocean Spray או Tree Top |
מקורות
- Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).
- Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease. Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).
- Kibar, Z., Capra, V., G....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
