Meyve sineği Drosophila melanogaster, erken gelişimi iyi görüntüleme yaklaşımlar için uygundur hücre şekil değişiklikleri bir dizi ile karakterizedir. Bu makale, Drosophila embriyolar canlı konfokal görüntüleme için gerekli olan temel araçları ve yöntemleri tanımlamak ve cellularization denilen bir hücreye şeklini değiştirmek üzerinde durulacak.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar
Bu makalede
Özet
Özet
Gelişmekte olan Drosophila melanogaster embriyo konfokal görüntüleme yaşamak için son derece müsait olan hücre şekil değişiklikleri bir dizi uğrar. Hücre sinek şekil değişiklikleri, yüksek organizmalarda benzer olup, doku morfolojilerinden sürücü. Yani, birçok durumda, yaptıkları çalışmada insan hastalığı (Tablo 1) 1-5 anlamak için doğrudan etkisi vardır. Hücre alt ölçekte, bu hücre şekil değişiklikleri, gen ekspresyonu, sinyal iletimi, hücre polarite, iskelet remodeling ve membran ticareti değişen faaliyetlerinin ürünüdür. Böylece, Drosophila embriyo doku morfolojilerinden ile ilgili olarak hücre şekil değişiklikleri değerlendirmek bağlamında sadece sağlar, ama aynı zamanda şekil hücreleri, alt-hücresel faaliyetler çalışma tamamen fizyolojik bir ortam sunmaktadır.
Burada açıklanan protokol görüntü cellularization denilen özel bir hücre şeklini değiştirmek için tasarlanmıştır. Cellularization, dramatik plazma membran büyüme bir süreç olduğunu ve sonuçta hücresel blastodermin sinsityal embriyo dönüştürür. Interfaz mitotik döngüsü 14 olduğunu, plazma zarı aynı anda birincil epitel hücrelerinin bir sayfa oluşturmak için her ~ 6000 cortically demirlemiş çekirdeklerinin etrafında invaginates. Sayaç önceki önerileri, cellularization Miyozin-2 kontraktilite 6 tarafından yönlendirilen değil, ancak bunun yerine büyük ölçüde iç mağazaları 7 zarının ekzositoz tarafından körüklenen . Böylece, cellularization sitokinez veya enine-borucuk (T-tübül) kas morfolojilerinden olarak plazma zarı invajinasyon veya genişleme gerektiren hücre şekil değişiklikleri sırasında membran kaçakçılığı eğitimi için mükemmel bir sistem.
Bu protokol sinek embriyo diğer hücre şekil değişiklikleri görüntüleme kolayca uygulanır ve sadece embriyo toplama aşamasında, değiştirme veya belirli bir oryantasyon (Tablo embriyo monte etmek için "embriyo tutkal" olarak hafif uyarlamalar gerektirir olduğunu unutmayın 1) 8-19. Tüm durumlarda, iş akışı temelde aynıdır (Şekil 1). Klonlama ve Drosophila transgenesis için standart yöntemler, Yeşil Floresan Protein (GFP) veya türevleri erimiş bir ilgi protein ifade istikrarlı sinek stokları hazırlamak için kullanılan ve bu sinekler, embriyo yenilenebilir bir kaynak sağlamak . Alternatif olarak, floresan proteinleri / problar doğrudan sinek embriyolara 9-10 basit mikro-enjeksiyon teknikleri ile tanıtıldı. Sonra, gelişimsel bir olay ve görüntülü olarak hücre şekil değişikliği göre, embriyolar toplanan ve diseksiyon mikroskobu morfolojisi tarafından sahnelenen, ve son olarak konumlandırılmış ve zaman atlamalı bir konfokal mikroskop görüntüleme için monte edilmiş.
Protokol
1. Embriyo Koleksiyon Bardaklar birleştirin
- Mümkün olduğunca pürüzsüz kenar, ustura ile 100 ml Üç mısır beher alt kesti. Bu kesinlikle gerekli olmasa da, bardak, aynı zamanda üst kapalı üç köşe Döşeme halinde ele kolaydır.
- Tel örgü (6 cm x 6 cm) bir kare kesin. Önceden ısıtılmış sıcak levha, iç davlumbaz, katman, ağır alüminyum folyo bir parça üstüne tel örgü kare. Kesme alt kenarı fincan sıcak örgü üzerine sıkıca bastırın. Birkaç saniye bekleyin ve şimdi bağlı mesh ile kupayı kaldırmayı. Folyo da sopalarla ise, sadece o kabuğu.
- Gecede bardağı soğutun. Ince taneli zımpara kağıdı ile herhangi bir keskin kenarları aşırı makas örgü, kum ve....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Protokol, burada, gelişmekte olan sinek embriyonun hücre şekil değişiklikleri bir dizi canlı, konfokal görüntüleme izin verecektir nitelendirdi. GFP stokları görüntüleme için ayrı bir laboratuvar (Tablo 2) tarafından hazırlanan, ancak pek çok hisse senedi de Indiana Üniversitesi'nden (Bloomington Drosophila Menkul Kıymetler Merkezi olarak merkezlerinin halka açık olabilir http://flystocks.bio.indiana.edu) ve flytrap Yale Üniversitesi (Menkul Kıymetler
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Biz minnetle, bu protokolü geliştirildi dayandığı temel Eric Wieschaus kabul etmiş sayılırsınız. Çalışmalarımız Verna & Marrs McLean, Biyokimya Anabilim Dalı ve Moleküler Biyoloji Başlangıç Ödülü, Baylor College of Medicine tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Slaytlar | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Lamella 25x25 | Fisher Scientific | 1 2-524C | |
| Sıkmalı şişeler (H2O) | Fisher Scientific | 02-897-11 | |
| 50 ml'lik Falcon tüpleri | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Küçük pipetler için ampuller, 1 mL | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Kapaklı sintilasyon şişeleri | VWR international | 66021-533 | |
| Tri-Corn Beherler, 100 mL | Elektron Mikroskopisi Bilimleri | 60970 | |
| BD Falcon Petri kabı 60x15mm | Fisher Scientific | 08757 100B | |
| BD Falcon Hücre Süzgeci | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Sarı pipet uçları | Rainin | L200 | |
| Paslanmaz çelik tel örgü, 304, 12x24 | Small Parts, Inc. | CX-0150-F-01 | |
| Cam 5¾ Pasteur Pipetleri | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| P4 filtre kağıdı | Fisher Scientific | 09-803-6F | |
| Lastikler | Office Max | A620645 | |
| Scotch çift taraflı bant, ½ inç | Office Max | A8137DM-2 | |
| Robert Simmons Expression resim fırçaları E85 yuvarlak #2 | Jerry’Sanal Tarama | 56460 | |
| Dumont #5 Penset Yüksek Hassasiyetli Inox | Elektron Mikroskobi Bilimleri | 72701-DZ | |
| Jiletler | VWR international | 55411-050 | |
| Halokarbon Yağı 27 | Sigma-Aldrich | H 8773 | |
| Heptan | Fisher Scientific | H360-1 | |
| BD Bacto Agar | VWR international | 90000-760 | |
| Sakroz | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| p-Hidroksibenzoik asit | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Red Star Aktif Kuru Maya | LeSaffre | 15700 | |
| Kağıt havlu, C-katlamalı | Kleenex | ||
| Yüksek dayanımlı alüminyum folyo | Reynolds Wrap | ||
| Çamaşır suyu | Austin’A-1 Ticari | ||
| %100 Elma suyu | Ocean Spray veya Tree Top |
Kaynaklar
- Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).
- Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease. Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).
- Kibar, Z., Capra, V., G....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
