تعديل Annexin الأبوطوزيس التأيد V / Propidium الفحص للحصول على تقييم دقيق للموت الخلية
Summary
وصفت طريقة دقيقة لتقييم موت الخلايا. بروتوكول يحسن عند التقليدية Annexin V / propidium البروتوكولات (PI) يوديد ، الذي عرض ما يصل إلى أحداث إيجابية كاذبة بنسبة 40 ٪ في خطوط الخلايا والخلايا الأولية من مجموعة واسعة من النماذج الحيوانية.
Abstract
وقد أجريت دراسات لموت الخلايا المبرمج الخلوية أثرت بشكل ملحوظ منذ تطبيق الأساليب المستندة إلى التدفق الخلوي. ويستخدم على نطاق واسع Propidium يوديد (PI) بالتزامن مع Annexin الخامس لتحديد ما إذا الخلايا قادرة على البقاء ، أفكارك ، أو من خلال الاختلافات في نخرية سلامة غشاء البلازما و1،2 النفاذية. الخامس / PI Annexin البروتوكول هو النهج المتبع عادة لدراسة الخلايا أفكارك 3. ويستخدم في أكثر الأحيان PI البقع النووية الأخرى لأنه من الناحية الاقتصادية ومستقر ومؤشر جيد على سلامة الخلية ، على أساس قدرتها على استبعاد الصبغة 4،5 في الخلايا الحية. PI قدرة على الدخول في الخلية يعتمد على نفاذية الغشاء ؛ PI لا صمة أفكارك الخلايا الحية أو في وقت مبكر بسبب وجود غشاء البلازما 1،2،6 سليمة. في أواخر الخلايا أفكارك ونخرية ، وسلامة الأغشية النووية والبلازما ينخفض 7،8 ، مما يسمح PI بالمرور عبر الأغشية ، ويقحم في الأحماض النووية ، وعرض مضان أحمر 1،2،9. للأسف ، نجد أن التقليدية Annexin V / PI بروتوكولات تؤدي إلى عدد كبير من الأحداث الإيجابية الزائفة (ما يصل الى 40 ٪) ، والتي ترتبط مع تلوين PI من الحمض النووي الريبي داخل المقصورة هيولي 10. تتأثر الخلايا الأساسية وخطوط الخلايا في طائفة واسعة من النماذج الحيوانية ، مع الخلايا الكبيرة (النووي : نسب حشوية <0.5) تبين حدوث أعلى 10. هنا ، علينا أن نظهر معدلة Annexin V / PI الأسلوب الذي يوفر تحسنا ملموسا لتقييم موت الخلايا ، مقارنة بالطرق التقليدية. هذا البروتوكول يستفيد من تغييرات في النفاذية الخلوية خلال تحديد الخلية لتشجيع دخول ريبونوكلياز ألف في الخلايا التالية تلطيخ. وكان كلا من توقيت وتركيز ريبونوكلياز الأمثل لإزالة RNA هيولي. والنتيجة هي تحسن كبير على البروتوكولات التقليدية V / PI Annexin (<5 ٪ مع الأحداث تلطيخ PI حشوية).
Protocol
Discussion
الخامس Annexin / بروتوكول PI المقدمة هنا هو نسخة معدلة من البروتوكولات التقليدية وتأخذ بعين الاعتبار وجود RNA في السيتوبلازم الذي لديه أيضا قابلية عالية للPI. إدخال ريبونوكلياز (50 ميكروغرام / مل) بعد خطوة تثبيت الفورمالديهايد 1 ٪ في وقت متأخر من تلطيخ الداخلي تحسن كبير في دقة تلطيخ PI النووية. لم يلاحظ أي آثار سلبية في تلطيخ PI النووية أو غشاء البلازما تلطيخ Annexin الخامس. وبدون علاج ريبونوكلياز ، يمكن أن تصل إلى 40 ٪ من النتائج وصمة عار PI يؤدي إلى أحداث إيجابية كاذبة ، الأمر الذي يؤدي إلى احتمال تأثير كبير وسلبي على النتائج النهائية 10.
لدينا بروتوكول تعديل Annexin تلطيخ V / PI بسيط واستخدمت على نحو فعال في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا (خلايا الأولية : الفئران الضامة نخاع العظم وsplenocytes ؛ الخنازير خلايا الرئة المقيمين ، البلاعم السنخية الرئة ، يعزل المساريقي العقدة الليمفاوية ، الكريات البيض في الدم المحيطي ، splenocytes ؛ الخلايا الأريمة الدجاج ؛ الضامة ذهبية الكلى الأولية ؛ الكريات البيض في الدم المحيطي المبروك ؛ خطوط الخلوي : RAW 264.7 الضامة ، Jurkat خلايا T ، الخنازير 3D4/31 الضامة ، CCL – 71 الليفية زعنفة سمكة ذهبية ، 3B11 خلايا B القرموط 10). ومن المهم أن نلاحظ أن تتأثر بشكل مختلف الخلايا كاذبة تلطيخ PI إيجابية ، مع وجود الخلايا الأولية عموما أكبر عدد من الأحداث الإيجابية الكاذبة 10. قد تكون الاختلافات كاذبة تلطيخ PI الإيجابية بين هؤلاء السكان الخلوية يعزى جزئيا إلى الاختلافات في حجم الخلية ، ولكن قد ينتج أيضا عن الاختلافات في محتوى الحمض النووي الريبي. على هذا النحو ، إدراج هذا الإجراء هو ذات الصلة ولا سيما بالنسبة للأنظمة التي تستخدم التجريبية ، من بين أمور أخرى ، تمر خلايا التوتر السامة للجينات والخلايا المعالجة بالأدوية اعتقال خلية دورة ثيميدين أو مثل هيدروكسي يوريا ، والخلايا المصابة فيروسي ، ودراسات حول الخلايا الجنينية حيث التقدم التنموي وتتميز بتغيرات في تركيب الحمض النووي الريبي منفصلة الخلوية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من جانب العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا منحة (NSERC) والزراعة ألبرتا اتحاد منحة لتمويل DRB. ويدعم من خلال المنح الدراسية AMR فانييه NSERC دراسات الكندية ، كأستاذ في جامعة ألبرتا التدريس والمنح الدراسية العليا الملكة اليزابيث الثانية.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 x PBS-/- | ||||
| 1 x Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | ||
| Annexin V-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes (Invitrogen) | A13201 | ||
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL in H2O | |
| 2% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1268 | ||
| RNase A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R4642 | ||
| DRAQ5 | Biostatus | DR50050 | Dilute 1:60 in 1 x PBS-/- |
References
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).
- Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. Flow cytometry of apoptotic cell death. J Immunol Methods. 243, 167-190 (2000).
- Cornelissen, M., Philippe, J., De Sitter, S., De Ridder, L. Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: An electron microscopic evaluation. Apoptosis. 7, 41-47 (2002).
- Fried, J., Perez, A. G., Clarkson, B. D. Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data. J Cell Biol. 71, 172-181 (1976).
- Bacso, Z., Everson, R. B., Eliason, J. F. The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented. Cancer Res. 60, 4623-4628 (2000).
- Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P., Traganos, F. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13, 795-808 (1992).
- Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).
- Denecker, G., Vercammen, D., Declercq, W., Vandenabeele, P. Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors. Cell Mol. Life Sci. 58, 356-370 (2001).
- Faleiro, L., Lazebnik, Y. Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier. J Cell Biol. 151, 951-959 (2000).
- Rieger, A. M., Hall, B. E., Luong, L. T., Schang, L. M., Barreda, D. R. Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death. J Immunol Methods. 358, 81-92 (2010).
- Edward, R. Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells. Mol. Cells. 27, 391-396 (2009).
- Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells. Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).
