Summary
Vi visar hur håriga roten komposit växter kan användas för att studera växt-Rhizobium interaktioner och nodulation i svåra att omvandla arter
Abstract
I likhet med Agrobacterium tumerfaciens kan Agrobacterium rhizogenes överföra främmande DNA i växtceller baserat på den autonoma rot-inducerande (RI) plasmiden. A. rhizogenes kan orsaka hårig roten bildas på växt vävnader och bilda sammansatta växter efter omvandling. På dessa sammansatta anläggningar, en del av den regenererade rötterna är transgena, bär den vilda typen T-DNA och konstruerade binära vektorn, medan skotten är fortfarande icke-transgena, som används för att ge energi och tillväxt stöd. Dessa håriga rot komposit växter kommer inte producera transgena frön, men det finns ett antal viktiga funktioner som gör dessa sammansatta fabriker mycket användbar i växtforskning. Först med ett brett spektrum av värdorganismer, A. rhizogenes kan omvandla många växtarter, särskilt dicots, vilket gör att gentekniken i en mängd olika arter. För det andra, A. rhizogenes infekterar vävnader och explants direkt, ingen vävnadskulturer före omvandling är nödvändig för att få komposit växter, vilket gör dem idealiska för att omvandla motsträviga växtarter. Dessutom kan transgena rot vävnader genereras inom några veckor. För Medicago truncatula, kan vi få transgena rötter i så kort som tre veckor, snabbare än normalt blommig dopp Arabidopsis omvandling. Totalt sett är håriga roten sammansatta vegetabiliska teknik ett mångsidigt och användbart verktyg för att studera genfunktioner och rot relaterad-fenotyper. Här kan vi visa hur håriga roten komposit växter kan användas för att studera växt-Rhizobium interaktioner och nodulation i svåra att omvandla arter M. truncatula.
Protocol
Följande protokoll har använts för att generera håriga rot komposit växter i en modell baljväxter M. truncatula. Liknande protokollen har anpassats i minst åtta växtarter 1-4. Vi använde M. truncatula håriga rot komposit växter för att studera gen funktioner i rot och liten knöl utveckling. Protokollet var uppdelad i fyra delar: 1) förbereda växtmaterial, 2) att generera håriga rot komposit växter, 3) symbiotiska rhizobia infektion, och 4) transgena rot identifiering. Vi använde det binära vektorn innehåller det grönt fluorescerande protein (GFP) genen som reporter för screening transgena rot i komposit växter 3. Jämfört med antibiotika-baserade urval, GFP-baserad screening snabbt, enkelt och billigt. I vår konstruktion är ER-uttrycket-optimerade GFP-genen drivs av super ubiquitin promotor, som har stark konstitutiva GFP signaler i transgena rötter, möjliggör enkel distinktion mellan transgena och icke-transgena rötter.
1. Förbereda växtmaterial
- M. truncautla frön skördas från växter som odlas i ett växthus (50% relativ luftfuktighet, 16 / 8 h ljus / mörker, 22/18 ° C dag / natt temperatur). Mogna frön kan lagras vid 4 ° C.
- Ca 100 frön är markberett i 10 ml koncentrerad svavelsyra (95-98%, Sigma-Aldrich, MO) i 10 min med periodisk skakning.
- Fröna sköljas 5-7 gånger med sterilt vatten under försiktig omrörning.
- Fröna är sedan dränkta i vatten i rumstemperatur i 6 timmar och förvaras vid 4 ° C i 36-48 timmar för att synkronisera grobarhet.
- Ungefär 20-30 frön sprids på fuktig filterpapper placeras i en petriskål. De hålls vid 22 ° C, med 16 / 8 h ljus / mörker-cykel och 40 μmol.m -2., S -1 ljusintensitet i 5-6 dagar.
- Grodde plantor överförs till jord och placeras i växthuset för en månad.
2. Generera Hårig Root Composite Växter
- Binära konstruktioner bär gener av intresse förvandlades till A. rhizogenes med standardprotokoll. Vi har konstruerad en uppsättning av binära vektorer som innehåller GFP-genen som en markör som underlättar screening av transgena vävnader. Dessa vektorer innehåller olika initiativtagare och alla har webbplatser Gateway kloning (Invitrogen, Carlsbad, CA) för över-uttryck eller tysta riktade gener 3,5.
- A. rhizogenes är odlade i 50ml LB medium med lämplig antibiotika urval på 28 ° C i 16-24 timmar.
- Bakterierna samlas och resuspenderas till en slutlig koncentration av OD 600 = 0.3 i en kvävefria växtnäring lösning (tabell 1 och 6).
- För att stödja håriga rot förnyelse, en steriliserad stödjande matris ("stenull", Hummert International Earth City, MO) skärs i pluggar på ca 3 cm 3. Vi ställer 4 pluggar i en petriskål.
- Ett hål är petade på toppen av varje plugin med hjälp av en pipett tips för att underlätta införandet av explants. A. rhizogenes (5 ml) tillsätts till varje kontakt.
- Ett skott avsnitt med 2-3 armhålan knoppar skärs av en sluttande snitt. Den Explantation sedan in i kontakten, och vuxit vid 22 ° C i ca tre veckor. Vi håller Medicago explants utan att vattna för de första 10 dagarna, då vattnet dem med 5 ml kvävefria lösning när det behövs. Vi fann att avlägsna apikala meristem kan minska bildningen av oavsiktlig rötter.
3. Symbiotiska rhizobia (Sinorhizobium Meliloti) Infektion
- Efter tre veckor kommer en del oavsiktlig rötter ur den stenull. Den håriga rot komposit växter överförs till sand eller vermikulit (steriliserad), med eller utan stenull. De odlas i växthus vid 22 ° C, 16 / 8 h ljus / mörker-cykel och 300 μmol.m -2. S -1 ljusintensitet för ännu en vecka.
- Före rhizobia infektion, S. meliloti 1201 är odlade i 50 ml jästextrakt-mannitol medium för 7 dagar vid 30 ° C (tabell 2 och 6,7).
- Resuspenderas rhizobia cellerna späds ut till en slutlig koncentration av OD 600 = 0,08 hjälp av kväve fri näring lösning. En 10-ml färska suspension av S. meliloti var tillämpas på varje sammansatta vegetabiliska att inducera knöl bildas.
4. Transgena Root Identification
- Två veckor efter rhizobia inokulationen den sammansatta växterna är upp rotade genom att tvätta i vatten. Rötterna kan separeras från sand eller perlit i vatten.
- Vi lägger håriga rötter under en UV-mikroskop (Nikon SMZ1500, excitation 460-500nm, kalljusreflektor 505nm, Barrier mer än 510nm). De transgena rötterna är GFP positiva och om tillfälliga rötter GFP negativa. Vi samlar då rötterna according GFP-signal och räkna knöl nummer, mäta roten längd, och beräkna lateral rot densitet. GFP negativa rötter används som kontroll.
5. Representativt resultat
I vårt experiment, den nya hårrötterna regenereras från explants i 2-3 veckor efter A. rhizogenes innoculation. Under UV-mikroskop, transgena rötter bär GFP-genen visar stark grön fluorescens (figur 1). Mängden av regenererad rötter och den del av GFP positiva rötterna beror på villkoren för explants och uppväxtmiljö av sammansatta plants.On genomsnitt var 25% av den producerade rötter transgena håriga rötter 3. För att öka omvandlingseffektiviteten, 1) plastskyddet undergång, som visas på video, är tillräckligt för att hålla luftfuktigheten i tillväxten facket för de första dagarna, och anläggningar som endast kräver lite vatten i de första dagarna. Överdriven bevattning är skadligt för hårig rot bildning, 2) koncentrationen av Agrobacterium innoculant är viktigt för omformning. Överdriven mängd celler är inte bra att håriga rot-bildning eller knöl bildas. För knöl bildningen behöver vattnas lösning som kväve-fria, annars kommer några knölar form.
Den håriga rot komposit växter kan genereras med hjärtbladen eller plantor Entact som utgångsmaterial. Endast mindre ändringar av ovanstående protokoll är ncessary att generera håriga rötter från andra vävnader 8. Viktigt är varje hårig roten en oberoende transformationshändelsen. Därför fenotyper observerats i en sammansatt anläggning är summan av flera transforamtion händelser som måste bekräftas av upprepningar i flera sammansatta växter
Figur 1. A. Transgena rötter kan redas ut ur håriga rötter. B. Noduli bildades i håriga roten komposit växter. Vi lade fyra veckor gamla M. truncatula håriga rot växter under UV-mikroskop och GFP-positiva rötterna lätt kan identifieras. (Röd pil: GFP rot; Gul pil: icke-GFP root)
| Stock | g/200ml | ml lager / liter |
| MgSO 4 0,7 H 2 O | 12,3 | 2 |
| CaCl 2 .2 H 2 O | 14,7 | 4 |
| K 2 HPO 4 0,3 H 2 O | 6,8 | 1 |
| K 2 SO 4 | 11 | 4 |
| Fe Cl 3 0,6 H 2 O | 0,49 | 2,5 |
| Mikronäringsämnen | Se nedan | 1 |
| Mikronäringsämnen | gram per liter |
| H 3 BO 3 | 0,142 |
| MnSO 4. H 2 O | 0,077 |
| ZnSO 4 0,7 H 2 O | 0,1725 |
| CuSO 4 .5 H 2 O | 0,037 |
| NaMoO 4. H 2 O | 0,024 |
| CoCl 2. H 2 O | 0,0025 |
| NISO 4 | 0,001 |
Tabell 1. Nitogen-fri kost lösning
| K 2 HPO4 | 0,5 g |
| NaCl | 0.1g |
| MgSO 4 · 7H 2 O | 0,2 g |
| Jästextrakt | 0.4g |
| Mannitol | 10g |
| pH = 6,8 |
Tabell 2. Jästextrakt mannitol medium (per liter)
Discussion
Generera håriga rot sammansatta vegetabiliska är en snabb och enkel metod att få stora mängder av transgena material för många dicot arter. Även om denna metod inte kan producera transgena frön, kan man producera transgena material i några veckor. Metoden är särskilt lämplig för växter som har svårt att upprättandet vävnadskulturer eller skapa stabila transformants. Under åren har vi använt denna teknik för att studera gen funktioner samt promotor, mikroRNA, rot och lateral rotutveckling, försvar och abiotiska stressreaktioner, nodulation och andra symbiotiska processer, reaktioner hormon, metabolisk profilering, gen profilering, proteomik analys och andra biologiska processer. Protokollet är robust och reproducerbart.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Chris Taylor (Ohio State University) för att införa hårig rot-teknik för att våra labb och Dr. Senthil Subramanian (South Dakota State University), Juan Zhang (Ludong universitet, Shandong Kina) för att förbättra protokollet. Vi vill också tacka Dr Hao Cheng (Nanjing jordbruk universitet) för att hjälper till att göra den här filmen. Detta arbete stöds delvis av anslag från DOE (DE-SC0001295), NSF (MCB-0.923.779) och USDA (2010-65116-20514) till Oy
References
- Limpens, E., Ramos, J., Franken, C., Raz, V., Compaan, B., Franssen, H., Bisseling, T., Geurts, R. RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 55, 983-992 (2004).
- Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin, L. W., Taylor, C. G. Ex vitro composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant J. 43, 449-457 (2005).
- Zhang, J., Subramanian, S., Stacey, G., Yu, O. Flavones and flavonols play distinct critical roles during nodulation of Medicago truncatula by Sinorhizobium meliloti. Plant J. 57, 171-183 (2009).
- Boisson-Dernier, A., Chabaud, M., Garcia, F., Becard, G., Rosenberg, C., Barker, D. G. Agrobacterium-rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 695-700 (2001).
- Zhang, J., Subramanian, S., Zhang, Y., Yu, O. Flavone synthases from Medicago truncatula are flavanone-2-hydroxylases and are important for nodulation. Plant Physiol. 144, 741-751 Forthcoming.
- Subramanian, S., Hu, X., Lu, G., Odelland, J., Yu, O. The promoters of two isoflavone synthase genes respond differentially to nodulation and defense signals in transgenic soybean roots. Plant Mol Biol. 54, 623-639 (2004).
- Vincent, J. A manual for the practical study of root nodule bacteria International Biological Program Handbook. , Blackwell Science Ltd. Oxford. 1-13 (1970).
- Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. RNA Interference of Soybean Isoflavone Synthase Genes Leads to Silencing in Tissues Distal to the Transformation Site and to Enhanced Susceptibility to Phytophthora sojae. Plant Physiol. 137, 1345-1353 (2005).
