Summary
Dit rapport toont een techniek voor mechanische isolatie van individuele levensvatbare neuronen te behouden bevestigd presynaptische boutons. Vibrodissociated neuronen hebben de voordelen van een snelle productie, een uitstekende farmacologische controle en een betere ruimte-clamp zonder invloed van naburige cellen. Deze methode kan gebruikt worden voor beeldvorming van synaptische elementen en patch-clamp opname.
Abstract
Mechanische dissociatie van de neuronen van het centrale zenuwstelsel heeft het voordeel dat de presynaptische boutons gehecht blijven aan de geïsoleerde neuron van belang. Dit maakt voor het onderzoek van synaptische transmissie onder omstandigheden waar de extracellulaire en postsynaptische intracellulaire omgeving goed kan worden gecontroleerd. Een trilling-gebaseerde techniek zonder het gebruik van proteasen, bekend als vibrodissociation, is de meest populaire techniek voor mechanische isolatie. Een micropipet, met de punt brand-gepolijst om de vorm van een kleine bal, wordt geplaatst in een plakje hersenen gemaakt van een P1-P21 knaagdier. De micropipet is parallel getrild om de slice oppervlak en verlaagd door middel van de slice dikte resulteerde in de bevrijding van geïsoleerde neuronen. De geïsoleerde neuronen zijn klaar voor studie binnen een paar minuten vibrodissociation. Deze techniek heeft voordelen ten opzichte van het gebruik van primaire neuronale culturen, de hersenen plakjes en enzymatisch geïsoleerde neuronen, waaronder: snelle productie van levensvatbare, relatief volwassen neuronen die geschikt zijn voor elektrofysiologische en imaging studies; superieure beheersing van de extracellulaire omgeving vrij van de invloed van de naburige cellen; geschiktheid voor de goed-gecontroleerde farmacologische experimenten met behulp van een snelle drug toepassing en totale cel superfusie en verbeterde ruimte-klem in whole-cell opnames ten opzichte van neuronen in de slice of celkweek preparaten. Dit preparaat kan worden gebruikt om synaptische fysiologie, farmacologie, de modulatie en plasticiteit onderzoeken. Real-time beeldvorming van zowel pre-en postsynaptische elementen in de levende cellen en boutons is ook mogelijk met vibrodissociated neuronen. Karakterisering van de moleculaire bestanddelen van pre-en postsynaptische elementen kunnen ook worden bereikt met immunologische en imaging-gebaseerde benaderingen.
Protocol
1. Voorbereiden Flame-afgesloten glazen Micropipet
- Met behulp van micro-elektrode glas, trek een standaard patch-clamp micropipet op een Flaming-Brown of gelijkwaardig micropipet trekker (tip diameter ~ 2 micrometer). Plaats micropipet tip in de vlam van een bunsenbrander voor ~ 2 sec tot een gesmolten bal vormen met een diameter van 200-300 urn.
- Plaats vlam afgedichte patch pipet op houder op een micromanipulator die snel kunnen worden getrild side-to-side (reisafstand 100 tot 200 micrometer) met behulp van een piëzo-elektrische bimorfe, relais, of een gelijkwaardig effectief apparaat.
2. Voorbereiden Brain Plakjes van P1-P21 ratten of muizen
- Bereid kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) met de volgende samenstelling (in mm): 124 NaCl, KCl 4,5, 1,2 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, en 10 D-glucose. Bubble oplossing met 95% zuurstof / 5% CO 2-gas voor ~ 15 min, voeg dan 2 mM CaCl 2 en 1 mM MgCl 2.
- Snijden hersenen plakjes:
- Verdoven van dieren met halothaan of isofluraan. Onthoofden dier - verwijder brein - blokkeren hersenen in de gewenste richting (coronaal, parasagittal, dwars, enz.) om gebieden van belang zijn.
- Bevestig de geblokkeerde hersenen fase van een trillend hersenen slicer ondergedompeld in aCSF - sectie hersenen op 250 tot 400 micrometer dik - plaats plakken in aCSF borrelen met carbogen in een "pre-incubatie" kamer op verrekening die zorgt voor een soepele / gas exposure op alle oppervlakken - laten plakken in dit medium equilibreren voor ten minste een uur.
3. Vibrodissociation
- Vul een 35 mm diameter cultuur schotel met HEPES-gebufferde zoutoplossing oplossing van de volgende samenstelling (mm): 150 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, een MgCl 2, 2,5 CaCl2, 10 D-glucose met een pH ingesteld op 7,4 met behulp van NaOH en osmolariteit aangepast aan ~ 300 mOsm met behulp van sucrose. Cultuur gerechten worden schorsing gerechten, standaard celkweek gerechten, cultuur gerechten met glazen dekglaasje inserts, of gerechten bedekt met, bijvoorbeeld, poly-L-lysine, afhankelijk van de behoefte aan sterkere cel naleving van de schotel bodem.
- Plaats de slice in de cultuur schotel en visualiseren met een dissectie stereoscoop bij 250 x. Houd slice naar de bodem met behulp van een gebogen platina draad (0,5 mm diameter) geplaatst op de bovenkant van de plak op te treden als een gewicht.
- Plaats de punt van de vlam afgesloten micropipet op de plak oppervlak in de gewenste hersengebied. Activeer micromanipulator naar de tip lateraal trillen op 10-30 Hz, met een excursie afstand van ~ 100 urn. Met behulp van de micromanipulator, verplaatst u de tip dieper in het plakje weefsel zodanig dat het door de hele slice binnen ~ 30 sec. Herhaal deze stap als nodig is om het aantal geïsoleerde neuronen te verkrijgen uit een bepaalde hersengebied te maximaliseren.
- Haal de tip van de slice - pick-up het segment met pincet en schud deze voorzichtig terwijl nog steeds in oplossing - dan volledig te verwijderen slice en gooi ze weg.
- Laat de gedissocieerde cellen om zich te vestigen en om de schotel bodem zich gedurende minstens 10 minuten.
4. Elektrofysiologische opname
- Plaats het schaaltje met neuronen op het podium van een omgekeerde microscoop en visualiseren met 10 x tot 63 x doelstelling. Kijk voor neuronen met een gladde patent membraan, geen blebbing, en een detecteerbaar, maar niet oversized kern. Als fase contrast optiek worden gebruikt, kijk voor fase-bright neuronen met een geel-tint, niet te blauw. Superfuse cellen met extracellulaire oplossing, die de gewenste zouten, voedingsstoffen, receptor antagonisten, etc. (onze standaard is de HEPES-gebufferde zoutoplossing bovengenoemde (paragraaf 3.1)), vaak aangevuld met 5 uM 2,3-dioxo-6-nitro-1, 2,3,4-tetrahydrobenzo [f] chinoxaline-7-sulfonamide dinatrium (NBQX) en 25-100 uM D-2-amino-5-phosphonopentanoic zuur (AP5) om ionotrope glutamaat receptoren die het mogelijk maakt voor het isoleren van een snelle GABA te blokkeren Een receptor-gemedieerde IPSCs 1,2.
- Trek een standaard patch micropipet met behulp van een Flaming-Brown of gelijkwaardig trekker. Pipetpunt weerstand moet 2-4 MΩ (afhankelijk van de beoogde celgrootte) gevuld met een Cl - - gebaseerde oplossing.
- Stel een whole-cell opname van een neuron gevisualiseerd met behulp van standaard elektrofysiologische technieken.
- Record spontane postsynaptische stroom (sPSCs) met behulp van een gap-free data-acquisitie protocol. Van toepassing zijn 0,2-1 uM tetrodotoxine en / of lage Ca 2 + - met extracellulaire oplossing voor miniatuur postsynaptische stromingen (mPSCs) record.
- Oplossingen en farmacologische middelen kunnen rechtstreeks worden toegepast op cellen. We maken gebruik van lokale superfusie van gesmolten vierkante getipt glazen buizen met een oplossing uitwisseling tussen zijwaartse beweging van de buis gemonteerd op een stappenmotor-motor aangedreven micromanipulator. Deze allowas voor oplossing uitwisseling in 10s tot 100s van ms tot snelle veranderingen in de extracellulaire moleculaire inhoud, toepassing van de receptor agonisten, enz. te bereiken
- Akaike en collega's hebben technieken ontwikkeld om te stimuleren een presynaptische boutons 3,4. Een micropipet is geplaatst in de buurt een gevisualiseerde Bouton en stimulans wordt gegeven (negatieve prikkel stromingen van 5-10 microAmpère, 0.1-0.2 ms duur). Unitaire IPSCs worden geregistreerd, en methoden zoals de methode van storingen kan worden gebruikt om veranderingen in de presynaptische en postsynaptische functie te onderzoeken.
5. Imaging presynaptische Terminals
- Postsynaptische neuronen kunnen gevuld worden met diverse kleurstoffen via de patch pipet. Neuronen kunnen ook worden gemaakt van muizen die fluorescerende eiwitten (KP's), zoals groen fluorescerend eiwit (GFP) in de geselecteerde cel populaties.
- Presynaptische terminals kunnen worden gevisualiseerd op vibrodissociated neuronen gemaakt van muizen die KP's in het bijzonder interneuron populaties uit te drukken. Bijvoorbeeld, muizen die GFP gedreven door de glutamaat decarboxylase 65 (GAD65) promotor tonen groene somata en processen in de hippocampus mand cellen en andere interneuronen. Vibrodissociated piramidale neuronen uit de hippocampus CA1 regio GFP-positieve axon terminals apposed om hun somata en proximale dendrieten (Figuur 1A). Piramidale neuronen vibrodissociated van muizen die uitdrukken synaptopHlourin (een pH-gevoelige GFP mutant gefuseerd met het synaptische vesikel-geassocieerd VAMP2 eiwit) ook onder controle van de Thy1 promotor FP-positieve aangesloten boutons dat pH-gevoelige fluorescentie (Figuur 1B) show.
- Presynaptische boutons kunnen worden geladen met calcium indicator kleurstoffen en andere fluorescerende moleculen met behulp van AM-veresterde verbindingen 5. Figuur 2 toont een voorbeeld van het laden van het gebruik van de calcium-indicator kleurstof Fluo4-AM. De eerste, 1-2 uM AM-veresterde kleurstof wordt toegepast op neuronen bij 37 ° gedurende 10 minuten. Kleurstof kan dringen in de intracellulaire omgeving, waar esterases klieven het molecuul, waardoor vrij, cel-en impermeant ongelest kleurstof. Deze aanpak laadt zowel pre-en postsynaptische cellulaire elementen. Na het laden worden de cellen gewassen met HEPES-gebufferde zoutoplossing en bewaard bij 37 ° C gedurende een extra 10 minuten. Voorafgaand aan het maken van een GΩ-seal met een glazen pipet elektrode, zijn de cellen gespoeld 3 keer met externe gebufferde oplossing.
- A whole-cell opname wordt dan vastgesteld aan de hand van een kleurstof-vrije intracellulaire oplossing. Na 2-5 minuten van de opname, is de kleurstof grotendeels verwijderd uit de postsynaptische neuron, waardoor visualisatie van Fluo-4-geladen synaptische boutons. Deze techniek is ontwikkeld door Ye et al. 5.
- De kleurstof-geladen boutons kan vervolgens worden gevisualiseerd met behulp van een hoge vergrotingsfactor, een hoge numerieke apertuur objectief met ofwel een camera-of multifoton microscoop. Gelijktijdig whole-cell opname en calcium beeldvorming kan worden bereikt met een opstelling zoals weergegeven in figuur 3. De beelden van de neuron en boutons weergegeven in figuur 2C werden gevangen met een elektron te vermenigvuldigen Charge Coupled Device (EMCCD) camera. De kracht van de lichtbron voor excitatie was verzwakte tot 1,2%, met een neutrale dichtheid van 1,0 filter en een iris-filter ingesteld op 12% vermogen. Calcium transiënten van de groene presynaptische boutons kunnen worden geobserveerd en geregistreerd in real time, en gemeten offline.
6. Representatieve resultaten:
Spontane en Current Injection-Evoked afvuren van Vibrodissociated Neuronen
Opnames van een typische vibrodissociated hippocampal CA1 pyramidale neuron zijn weergegeven in figuur 4A. Spontane overschrijding actiepotentialen kunnen worden waargenomen in piramidale neuronen los te zien van de rat basolaterale amygdala, hippocampus en de VTA 1,5. Tijdens de current-clamp opnamen van CA1 pyramidale neuronen, hyperpolarizing huidige injectie levert een typische spanning de reacties, terwijl depolariserende stroom van voldoende omvang overschrijding actiepotentialen te lokken met de typische vertraagde vuurpatroon met matige huidige niveaus en niet-meegaand actiepotentialen in reactie op de sterkere stroom te injecteren ( Figuur 4B).
Spontane en Miniatuur GABAergische remmende postsynaptische Stromingen in Vibrodissociated Neuronen
Tijdens de voltage-clamp opnamen met een CsCl-gebaseerde intracellulaire oplossing, zijn spontane synaptic stromingen waargenomen (figuur 5A). Deze gebeurtenissen worden geëlimineerd in lage calcium-bevattende oplossing 2,6, en in de meeste neuronale types zijn volledig geblokkeerd door de GABA-A receptor antagonisten, zoals bicuculline of gabazine (Figuur 5B, C), wat aangeeft dat deze sIPSCs gemedieerd door GABA release en activering van deze ionotrope receptor subtype. Echter, in principe neuronen van de hersenen regio's zoals de basolaterale amygdala 2 en het ventrale tegmentale gebied 5,7, GABA-A receptor blokkadeonthult kortere duur EPSCs gemedieerd door glutamaat activering van AMPA-type receptoren. Interessant is dat de toepassing van TTX bij concentraties die specifiek zijn voor blokkade van de meest toxine-gevoelige voltage-gated natriumkanalen vermindert de frequentie en amplitude van de sIPSCs waargenomen in vibrodissociated neuronen uit verschillende gebieden van de hersenen (figuur 6A) 2,4,7. Zo, natrium-kanaal activiteit neemt deel aan GABA release in de beknelde-off synaptische boutons. Het is nog niet duidelijk of full-blown natrium actiepotentialen optreden in deze terminals. Het is vermeldenswaard dat de ingangsweerstand van een goed afgesloten 1 uM diameter axon terminal is waarschijnlijk tot ver in de GΩ bereik. Zo zou de opening van zelfs een klein aantal van de natriumkanalen voldoende op de klemmen depolariseren de calcium kanalen die excitatie secretie koppeling bemiddelen activeren. Over het onderwerp van deze calcium-kanalen zijn er aanwijzingen dat N en P / Q-type kanalen deel te nemen in release op GABA-erge terminals in de vibrodissociated voorbereidingen van de hippocampus CA1 en elders 8.
Modulatie en plasticiteit van overdracht door een aantal neurotransmitters en receptoren is onderzocht met behulp van vibrodissociated neuronen 3,4,9. De neurotransmitters aangetoond dat dergelijke modulerende acties zijn adenosine, GABA, serotonine, endocannabinoïden, etc 2,6,10,11,12. Daarnaast heeft de korte termijn synaptische plasticiteit, zoals endocannabinoïde-afhankelijke depolarisatie-geïnduceerde onderdrukking van de inhibitie (DSI) ook beschreven in dit preparaat 2,11. Deze bevindingen wijzen erop dat vele vormen van receptor-gemedieerde en trans-synaptische signalering door endogene neuromodulatoren intact zijn in de vibrodissociated voorbereiding.
Calcium transiënten en vesiculaire Release in Axon Terminals in de Vibrodissociated Preparation
Met behulp van de EMCCD uitgeruste omgekeerde microscoop hierboven beschreven, hebben we onderzocht calcium transiënten in presynaptische terminals in de vibrodissociated neuron-Bouton voorbereiding. Figuur 2 toont cel laden met AM-veresterde Fluo-4 en de daarop volgende postsynaptische kleurstof verdunning in een hippocampal CA1 piramide neuron. Spontane calcium transiënten zijn waargenomen bij sommige dye-gevulde boutons getoond als regio's van belang (ROI) in figuur 6B. Toepassing van een uM tetrodotoxine (TTX) elimineert deze spontane transiënten, waaruit blijkt dat zij worden gemedieerd door activering van voltage-gated sodium stromingen die spontaan worden geactiveerd in boutons, wat leidt tot de volgende calcium stijgt. Het verhogen van extracellulaire KCl van 10 mm tot 40 mm met een snelle oplossing uitwisseling een verhoogde fluorescentie gemeten in ROI die overeenkomen met de presynaptische terminals (Figuur 7A). Gelijktijdige opname van het postsynaptische neuron wordt gebruikt voor het sIPSCs volgen en indien event frequentie wordt verhoogd door een hoge-K + depolarisatie (Figuur 7B) te bepalen.
Te visualiseren blaasje fusie in de presynaptische boutons we hebben gebruikt muizen die de synaptopHlourin bouwen onder de controle van de Thy1 promoter (het label spH21 muizen). SynaptopHluorin in een moleculaire constructie waarin de ecliptica pHlourin (een GFP-mutant met een verhoogde pH-gevoeligheid) 12 is gekoppeld aan het blaasje bijbehorende membraaneiwit (VAMP2) 13. Deze regeling situeert de pHlourin motief in de vesicle lumen, waar het relatief zure omgeving lest fluorescentie. Bij het blaasje fusion dit motief is blootgesteld aan de meer neutrale extracellulaire omgeving met een daaruit voortvloeiende toename van de fluorescentie bij puncta die overeenstemmen met blaasjes / presynaptische terminals. Vibrodissociation van hippocampale neuronen van spH21 muizen zorgt voor visualisatie van fluorescerende puncta van de grootte en de locatie verwacht voor GABA-erge terminals (Figuur 8A). Toepassing van de hoge-K + - met een externe oplossing verhoogt fluorescentie in deze terminals, en dit effect is geblokkeerd in de aanwezigheid van een externe oplossing waarbij extracellulair calcium wordt gereduceerd tot 0,2 mm (Figuur 8B). Zo is de depolarisatie-geïnduceerde toename in fluorescentie blijkt excitatie-secretie koppeling reflecteren op GABA-erge synapsen in de neuron-Bouton voorbereiding.
De mogelijkheid om presynaptische calcium transiënten en blaasje fusie in axon terminals van het neuron-Bouton voorbereiding maat stelt ons in staat om te onderzoeken effecten van neuromodulatoren, drugs en synaptische plasticiteit op presynaptische mechanismen betrokken bij excitatie-secretie koppeling en exocytose / endocytose. Deze technieken kunnen ook worden gecombineerd met andere moleculaire technieken en de genetisch gemanipuleerde muizen om de rol van specifieke eiwitten in presynaptische functie en modulatie / plasticiteit onderzoeken.
Figuur 1. Vibrodissociated neuronen van de hippocampus CA1 regio (A) samengevoegde afbeelding van DIC eennd groene fluorescentie beelden van een GAD65 muis. DIC beeld wordt samengevoegd worden duidelijk de locaties van de groene terminals (B) Fluorescentie beeld uit een synaptophluorin (spH21) muis. Schaalbalk = 10 micrometer
Figuur 2 Calcium indicator-loading procedure: (A) hele cel is geladen met AM-veresterde kleurstof; (B) whole-cell opname verdunt kleurstof; (C) terminals worden gevisualiseerd als regio's van belang (pijlpunten)..
Figuur 3. Schematische weergave van de experimentele opstelling voor gelijktijdige whole-cell imaging opname en calcium in presynaptische terminals op vibrodissociated neuronen. EMCCD = elektron te vermenigvuldigen Charge Coupled Device.
Figuur 4. Vertegenwoordiger van golfvormen zien (A) spontane actiepotentialen van een vibrodissociated CA1 neuron en (B) membraan spanning reacties op hyperpolarizing en depolariserende stroom injecties in de huidige-clamp opnamen van een CA1 neuron.
Figuur 5. (A) Vertegenwoordiger golfvormen van spontane IPSCs uit een CA1 piramide neuron. (BC) De IPSCs werden geblokkeerd door een van beide gabazine (10 uM, B) of bicuculline (20 micrometer, C).
Figuur 6. TTX remt de spontane GABAergische synaptische transmissie, en elimineert presynaptische calcium transiënten in de hippocampus vibrodissociated voorbereiding. (A) Opnemen van een vibrodissociated neuron voor en tijdens de TTX applicatie. Let op de afname van de frequentie en amplitude van sIPSCs. (B) Calcium passanten waargenomen in een Fluo-4-geladen presynaptische terminal op een vibrodissociated neuron voor en tijdens de TTX applicatie. Let op de volledige verlies van de transiënten.
Figuur 7. Gelijktijdige calcium indicator beeldvorming en sIPSC whole-cell opnemen met effecten van hoge K + stimulatie. (A) Fluorescentie gemeten over de tijd uit een presynaptische bouton geladen met Fluo-4AM kleurstof. (B) gelijktijdige toename van sIPSC frequentie en amplitude tijdens hoge K +-toepassing.
Figuur 8. Ca 2 +-afhankelijke high-K + reactie in presynaptische boutons van spH21 piramidale neuronen uit de hippocampus CA1 regio. (A) Fluorescentie beeld van een vibrodissociated neuron. (B) High-K + toepassing (aangeduid door de zwarte balk) resulteerde in een aanhoudende toename van de fluorescentie in het bijzijn van onze normale extracellulaire Ca 2 +-bevattende oplossing (2 mM Ca2 +). Geen fluorescentie stijging werd waargenomen bij lage extracellulaire Ca 2 + (0,2 mM Ca 2 +). De gegevens in grafiek werden genormaliseerd om pre-high-K + fluorescentie levels, en tonen de gemiddelde reactie van 3 boutons.
Discussion
Succesvolle vibrodissociation vereist dat de schijfjes gezonde neuronen bevatten en dat de interstitiële ruimten zijn flexibel genoeg om neuronen aan de slice af te sluiten zonder toxische schade. Zo is de techniek werkt optimaal bij vroege postnatale leeftijd (P1-21) als gezond plakjes gemaakt kan worden met minder gliale / interstiatial materiaal dan wordt aangetroffen in volwassen hersenen plakjes. In onze ervaring, echter, het optimaliseren van slice voorbereiding op de neuronale overleving in de slice zelf kan contraproductief zijn voor de vibrodissociation techniek. Terwijl we routinematig voorbereiden plakjes voor in-situ opname met koud gewijzigd aCSF waarin sucrose is vervangen voor een groot deel van de extracellulaire Na + en Ca 2 +, plakjes voorbereid voor vibrodissociation kunnen worden bereid (bijv. snede) in ons normale opname aCSF. Bij de voorbereiding plakjes voor het opnemen van individuele neuronen in de plakken we zelf ook plaats plakken in de normale aCSF bij 35 ° C net na het snijden en laat ze gedurende 30-60 minuten bij deze temperatuur alvorens terug te keren ze op kamertemperatuur. Echter, plakjes voorbereid voor vibrodissociation onmiddellijk naar kamertemperatuur net na het snijden. Deze procedures zorgen voor een hogere opbrengst van gezonde neuronen na vibrodissociation, misschien te wijten aan het ontbreken van ferme bindweefsel waarmee neuronen gemakkelijker worden geschud los van het schijfje zelf. We hebben nog niet uitputtend onderzocht slice voorbereiding van omstandigheden, zoals we regelmatig voldoende neuronen voor onze opname-en imaging-experimenten te verkrijgen over een bepaalde dag. Het is mogelijk dat extra aanpassingen, zoals veranderingen in slice dikte of preincubaton procedures, kunnen worden gemaakt om de opbrengst van gezonde neuronen te verhogen. Zeer milde protease behandelingen zijn uitgeprobeerd in een poging om de cel opbrengst te verhogen en krijg de techniek aan de slag bij oudere dieren. Maar steevast zelfs lichte protease behandeling lijkt te verstoren synaps functie. Dus, terwijl de combinatie van protease en mechanische dissociatie kan nog steeds worden gevonden om te werken is het niet betrouwbaar bewezen voorhersenen neuronen tot nu toe.
Het moet ook worden gewezen op de relatief lage opbrengst van gezonde neuronen na vibrodissociation betekent dat de techniek is vooral nuttig voor het bestuderen van overvloedige neuronale subtypes, voornamelijk projectie neuronen. De beschikbaarheid van GFP-expressie muizen waarin kleine neuronale subpopulaties gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd verhoogt de kans op het bestuderen van deze zeldzamer neuronen. Maar tenzij neuronale opbrengst kan aanzienlijk worden verbeterd accumulatie van gegevens over deze neuronen is waarschijnlijk relatief langzaam.
Een aantal stappen hebben bewezen dat het succes van het laden van de neuronen met calcium-sensing kleurstoffen. Blootstelling aan AM-veresterde kleurstof wordt uitgevoerd bij 37 ° C, en we hebben het ongelijk zijn gesteld in het proberen om dye-load bij lagere temperaturen. De concentratie van de kleurstoffen moeten worden geoptimaliseerd rekening houdend met zowel het laden van de tijd en de temperatuur, omdat blijkt dat hogere concentratie van de kleurstof-loading verlaagt calciumconcentratie in de presynaptische boutons. We hebben waargenomen dat het laden met hogere concentraties van de frequentie en de amplitude van sIPSCs af. Bij het laden van calcium-sensing kleurstoffen in presynaptische terminals van vibrodissociated neuronen, moet erop worden gelet, omdat bufferend vermogen van de kleine presynaptische boutons kan anders zijn dan in de soma en de afmetingen van boutons zijn niet consistent. Neuron-bevattende gerechten worden gewassen met HEPES-gebufferde externe oplossing na dye-loading, en de hersteltijd na het wassen is cruciaal. Bovendien, om een goede afdichting voor het whole-cell opname te maken, moeten de cellen grondig worden gewassen om zich te ontdoen van niet-geïnternaliseerde dye moleculen uit de buitenste celmembraan.
Naast het gebruik van vibrodissociated neuronen voor elektrofysiologie en live cell imaging, kan immunocytochemische technieken ook worden toegepast op deze cellen 11,12. Cellen kunnen eenvoudig worden gefixeerd en gekleurd met een verscheidenheid aan antilichamen en andere cel markers. Het gebruik van deze cellen zorgt voor een schone voorbereiding voor visualisatie van eiwitexpressie in GABAergische presynaptische terminals. Met behulp van muizen die fluorescerende eiwitten te uiten onder de controle van promotors die specifiek zijn voor GABA-erge neuronen kan de onderzoeker te identificeren individuele synaptische terminals in de voorbereiding van de vibrodissociated (figuur 1). Imaging fluorescente markers van dit type kunnen zorgen voor morfologische metingen in terminals met behulp van laser-gebaseerde microscopie en nieuwere technieken zoals STED (Stimuleringsprogramma Emission Depletion Microscopy). Visualisatie met kleurstoffen die synaptische vesicles fietsen rapport is ook mogelijk met deze voorbereiding. Akaike en collega's hebben bestempeld GABAergische terminals met de styrylkleurstoffen kleurstof, FM1-43 aan op de klemmen in levende cellen 4 te visualiseren.
Het moet ook mogelijk zijn om single-cell reverse transcriptase-PCR uit te voeren naar het profiel van RNA-expressie in vibrodissociatedneuronen. Deze techniek wordt routinematig toegepast op enzymatisch-gesplitste neuronen en neuronen gekweekt in celkweek.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen graag Drs erkennen. Ping juni Zhu en Susumu Koyama voor hun hulp tijdens de eerste opzet van de techniek, en Dr Veronica Alvarez voor hulp bij het formatteren van de geschreven manuscript. Deze studie werd gefinancierd door de Afdeling Klinische en Intramurale Biomedical Research van NIAAA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibrating Tissue Slicer | Leica Microsystems | VT1200S | |
| Cell Culture Dish (35 mm) | BD Biosciences | 353001 | |
| Glass Bottom Dishes | Willco-dish | GWSB-5040 Or GWSB-3522 | 0.16-0.19 mm glass thickness for imaging |
| Piez–lectric Manipulator | EXFO | LSS-3000 | Could also use relay, etc. |
| SD9 Square Pulse Stimulator | Grass Technologies | SD9K | For triggering piez–lectric manipulator |
| Dissecting Stereoscope | Wild Heerbrugg | TYP 374590 | Could also use any stereoscope |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW-150F-4 | For flame-sealed glass micropipette and patch micropipette |
| Six Channel Perfusion Valve Control Systems | Warner Instruments | VC-6 or VC-6M | |
| Perfusion Fast-Step | Warner Instruments | SF-77B | |
| Inverted Microscope with 20-63x objectives | Nikon Instruments | TS200 Diaphot | |
| EMCCD Camera | Andor | iXonEM+ DU-888 | |
| Excite Fluorescence Illumination Light Source | EXFO | X-Cite 120PC | |
| Fluo-4, AM calcium indicator | Molecular Probes, Life Technologies | F14201 |
References
- Zhu, P. J., Lovinger, D. M. Ethanol potentiates gabaergic synaptic transmission in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala. J Neurophysiol. 96, 433-441 (2006).
- Zhu, P. J., Lovinger, D. M. Retrograde endocannabinoid signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala. J Neurosci. 25, 6199-6207 (2005).
- Akaike, N., Moorhouse, A. J. Techniques: Applications of the nerve-bouton preparation in neuropharmacology. Trends Pharmacol Sci. 24, 44-47 (2003).
- Akaike, N., Murakami, N., Katsurabayashi, S., Jin, Y. H., Imazawa, T. Focal stimulation of single gabaergic presynaptic boutons on the rat hippocampal neuron. Neurosci Res. 42, 187-195 (2002).
- Ye, J. H., Wang, F., Krnjevic, K., Wang, W., Xiong, Z. G., Zhang, J. Presynaptic glycine receptors on gabaergic terminals facilitate discharge of dopaminergic neurons in ventral tegmental area. J Neurosci. 24, 8961-8974 (2004).
- Koyama, S., Matsumoto, N., Kubo, C., Akaike, N. Presynaptic 5-ht3 receptor-mediated modulation of synaptic gaba release in the mechanically dissociated rat amygdala neurons. J Physiol. 529, 373-383 (2000).
- Deng, C., Li, K. Y., Zhou, C., Ye, J. H. Ethanol enhances glutamate transmission by retrograde dopamine signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from the ventral tegmental area. Neuropsychopharmacology. 34, 1233-1244 (2009).
- Murakami, N., Ishibashi, H., Katsurabayashi, S., Akaike, N. Calcium channel subtypes on single gabaergic presynaptic terminal projecting to rat hippocampal neurons. Brain Res. 951, 121-129 (2002).
- Zhu, P. J., Lovinger, D. M. Persistent synaptic activity produces long-lasting enhancement of endocannabinoid modulation and alters long-term synaptic plasticity. J Neurophysiol. 97, 4386-4389 (2007).
- Inada, H., Maejima, T., Nakahata, Y., Yamaguchi, J., Nabekura, J., Ishibashi, H. Endocannabinoids contribute to metabotropic glutamate receptor-mediated inhibition of gaba release onto hippocampal ca3 pyramidal neurons in an isolated neuron/bouton preparation. Neuroscience. 165, 1377-1389 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptophluorin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6131-6136 (2005).
