Summary
Bu video formalin ile fikse parafine gömülü malzeme DNA ekstraksiyonu için protokol göstermektedir. Bu doku kesitlerinde ksilen ile deparafinize olduğu bir çok günlük bir prosedür, etanol ile sulandırılır ve sonraki gen-spesifik veya genom analizi için DNA arındırmak ve izole etmek için proteinaz K ile tedavi edilir.
Abstract
Hastalık gelişimi ve ilerlemesi kromozom düzenlenmeleri, kopya sayısı kazançlar ve kayıplar ve DNA metilasyon dahil olmak üzere sık sık genetik ve epigenetik sapmaları ile karakterizedir. Gelişmeler, bu tür mikroarray'ler yüksek verimli, genom profil teknolojileri, bu belirli değişikliklerin belirlenmesi ve tespit etmek için yeteneğimizi önemli ölçüde iyileştirilmiştir. Ancak olarak teknoloji geliştirmeye devam etmektedir, sınırlayıcı bir faktör örnek kalite ve yer durumu kalır. Ayrıca, takip klinik bilgi ve hastalık sonucu genellikle ilk örnek toplama yıl sonra tahsil edilir. Numuneler, onlarca yıllık, genellikle formalin ile fikse ve parafin (FFPE) yıl boyunca hastane arşivinde saklanır. Uygun ekstraksiyon yöntemi uygulandığında ise DNA, verimli ve etkili parafine gömülü dokulardan kurtarıldı olabilir. Yüksek kaliteli, düzgün bir şekilde korunmuş ve depolanan örneklerin çıkarılan DNA genetik ve epigenetik imzaları 1 normal ve hastalıklı dokuları ve üretim karşılaştırmalar için kantitatif testleri destek olabilir . , Parafine gömülü örnekleri, doku çekirdek veya microdissected doku DNA ayıklamak için, doku parafin erir ksilen tedavisi, tabi, ve ardından bir dizi etanol yıkar kullanarak rehidrate. Proteinler ve sonradan proteinaz K. lizis tamponu, sodyum dodesil sülfat (SDS) olarak denatüre edici ajanlar içerir, sindirimi 2. kolaylaştıran, ek, nükleazlar gibi zararlı enzimlerin sindirilir . Nükleik asitler, bifazik bir çözüm üretir tampon doymuş fenol ve yüksek hızda santrifüj kullanarak doku lizatı arınmış. DNA ve RNA, proteinler, lipidler ve polisakkaritler arası ve organik faz ise sekestre ise, üst sulu faza kalır. Sulu faz ve tekrarlanan fenol ekstraksiyon Tutma temiz bir örnek oluşturur. Fenol ekstraksiyon, RNaz A kirlenmesine neden olan RNA ortadan kaldırmak için eklenir. Ek fenol ekstraksiyon RNaz ile inkübasyon aşağıdaki A kalan herhangi bir enzim kaldırmak için kullanılır. Ayrıca sodyum asetat ve izopropanol çökeltileri DNA ve yüksek hızda santrifüj pelet DNA ve izopropanol çıkarma işlemini kolaylaştırabilir. Yağış taşınan Fazla tuzları sonraki enzimatik deneyleri ile müdahale, ancak% 70 etanol ile yıkanarak yeniden pelet DNA 3 santrifüj takip DNA çıkarılabilir. DNA, distile su veya seçim tampon yeniden askıya sayısal ve -20 ° C'de saklanan Arıtılmış DNA sonradan dahil downstream uygulamalarında kullanılan, ancak bunlarla sınırlı değildir, PCR, dizi karşılaştırmalı genomik hibridizasyon 4 (dizi CGH), denatüre DNA Immunoprecipitation (MeDIP) ve bütünleştirici bir doku / tümör örneklerinin analizi için izin sıralama.
Protocol
Discussion
Histopatolojik analizi ve tanı için biyopsi veya cerrahi olarak eksize dokuların uzun süreli saklanması için genellikle formalin sabit ve parafin (FFPE). Bu örneklerin DNA ayıklamak için, hastalığın genetik temeli anlamak giderek artan bir ilgi ile genomik analiz ve translasyonel çalışmaları için kullanılabilir tanı malzeme paha biçilmez bir kaynak temsil eder. Nükleik asitlerin ağır 6 bağlayan protein, nükleik asit ve protein-protein çapraz tarafından değiştirilmiş olabilir Tarihsel FFPE örnekleri moleküler analiz için uygun bir kaynak sayılmaz . Ancak, proteaz sindirim, PCR, dizi CGH, sıralama ve metilasyon profili de dahil olmak üzere alt analizler için uygun olan nükleik asitlerin parçalanmış bültenleri keşfi genetik analiz 6 için bu değerli örneklerinin kullanımı sağlar.
Parafine gömülü dokulardan DNA ekstraksiyonu DNA arındırmak için diferansiyel çözünürlüğü dayanmaktadır sağlam bir işlemdir. Çıkarılan DNA nitelik ve nicelik ve sonraki DNA amplifikasyon başarı çıkarma sırasında ve sonrasında, önce bir dizi parametre bağlıdır. Bunlar, ancak bunlarla sınırlı değildir: doku tipi ve miktarı, doku korunması için kullanılan fiksatif türü, fiksasyon süresi, yaş parafin blok ve saklama koşulları gibi istenen DNA segmentinin uzunluğu 1,7 amplifiye. Çözünmemiş parafin kötü örnek kalite ve PCR inhibisyonu dokusundan parafin kaldırılması başarılı çıkarılması için en kritik adımdır.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz, bu video ve makale değerlendirme ve eleştiriler için Lam laboratuar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri fon tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | VWR international | CABDH6216- 4 | - |
| 1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Sorenson BioScience | 11510 | - |
| Spectrafuge 16M Microcentrifuge | Labnet International | C0160-B | - |
| Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K |
||
| Proteinase K Stock Solution | Invitrogen | AM2548 | 20 mg/ml |
| Proteinase K Stock Solution | |||
| Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9 | Fisher Scientific | BP1750I-400 | - |
| Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) | Fisher Scientific | BP1752I-400 | - |
| RNase A | Roche Group | 10109169001 | 100mg |
| 3M sodium Acetate pH 5.2 | 40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave |
||
| ND 3300 Spectrophotometer | NanoDrop | - | - |
References
- Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).
- Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins. Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).
- Sambrook, J. oseph, R, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
- Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp. , (2008).
- Thu, K. L. Methylated DNA immunoprecipitation. J Vis Exp. , (2009).
- Tang, W. DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Cold Spring Harb Protoc. , (2009).
- Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).
